猪骨骼肌脂肪酸组成变异的转录因子与功能SNP关联分析

本研究通过整合SNP芯片基因分型和转录组数据，系统鉴定了影响猪骨骼肌脂肪酸（FA）组成变异的表达数量性状位点（eQTL）、候选功能单核苷酸多态性（SNP）及脂质代谢相关转录因子（TF）。研究揭示了74,254个eQTL（包括15,558个顺式eQTL和58,696个反式eQTL）、23个eQTL热点区域，并识别出EGR1、SP1、CREB3和INSM1四个关键转录因子。全基因组关联分析（GWAS）进一步发现两个与油酸和亚麻酸显著关联的SNP，并挖掘出PITX3、NT5C2、FTL等与肉质和人类健康相关的候选基因。这些发现为解析猪脂质代谢的分子调控网络及改善猪肉营养价值提供了重要理论依据。

　　

摘要

猪肉是人类膳食中脂肪酸（FA）的重要来源。脂肪酸参与多种生物过程并影响转录调控。本研究旨在利用大白猪的SNP芯片基因分型和腰最长肌转录组数据，鉴定与FA组成变异相关的候选功能SNP和eQTL，以及脂质代谢相关转录因子。共识别105,378个独特SNP，其中74,955个来自RNA-Seq数据，30,423个来自猪50K SNP芯片。通过matrixeqtl包分析这些SNP与骨骼肌基因表达数据（15,090个基因）的关联，发现74,254个eQTL，包括15,558个顺式eQTL和58,696个反式eQTL。进一步识别出23个eQTL热点区域和四个脂质代谢相关转录因子：EGR1、SP1、CREB3和INSM1。全基因组关联分析鉴定出两个与猪骨骼肌中油酸和亚麻酸显著关联的SNP。候选基因包括PITX3、NT5C2、FTL、GLIS1、API5和HILPDA，这些基因此前被报道影响猪的肉质和人类健康。尽管样本量有限，但本研究为代谢疾病响应和脂质代谢提供了新见解，有助于深入理解猪脂质代谢、肉质和FA组成的基因表达调控机制。

引言

猪肉是全球最常见生产和消费的肉类之一，是人类重要的蛋白质来源，直接影响人类健康。猪也被用作研究人类疾病的生物医学模型。近年来，改善猪肌肉和脂肪组织中FA组成以提高猪肉营养价值受到广泛关注。肌内脂肪（IMF）的FA组成显著影响猪肉的营养和感官品质。例如，单不饱和脂肪酸（MUFA）与肌肉的氧化稳定性相关，能增强肉类的口感和色泽；不饱和脂肪酸的摄入与心血管疾病风险降低相关。消费者更青睐高IMF的猪肉，因其能提供更均衡的FA组成。

复杂性状（如肉质和FA组成）的遗传基础可通过高通量测序和基因表达分析技术阐明，例如表达数量性状位点（eQTL）分析。eQTL是调控基因表达的DNA变异，有助于解析复杂性状的表型变异。结合全基因组关联研究（GWAS）和eQTL分析，能识别与目标性状相关的候选致病基因、突变或生物通路。SNP可能通过创建或破坏转录因子结合位点（TFBS）影响基因表达。遗传变异 within TFBS 可改变基因表达，进而影响复杂性状的表型多样性。

材料与方法

动物与样本

研究选取72头纯种免疫去势大白公猪，均为Halothane基因纯合阴性（NN）。猪只自由采食和饮水，实验日粮为玉米-豆粕型生长-育肥料，添加不同油脂。屠宰后立即采集腰最长肌（LL）样本，液氮速冻后-80°C保存用于RNA提取。

表型数据

分析的FA包括棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、MUFA、PUFA、Omega-3（n-3）和Omega-6（n-6）。FA组成通过Bligh-Dyer冷提取法和气相色谱法测定。

RNA提取与测序

使用RNeasy Mini Kit提取总RNA，质检合格后构建文库，Illumina HiSeq2500平台进行测序。原始数据经trim galore质控，STAR软件比对到猪参考基因组（Sus scrofa 11.1）。

SNP识别与质控

利用GATK进行变异检测，经质量评分≥30、覆盖深度≥30、次要等位基因频率≥0.05等过滤后，获得74,955个RNA-Seq来源SNP。合并50K芯片的30,423个SNP，经Plink质控后保留105,378个SNP用于后续分析。

eQTL分析

使用matrixeqtl包进行eQTL分析，以基因表达量（TPM标准化）为因变量，SNP基因型、前4个主成分（解释41.50%变异）和处理效应为固定效应。顺式eQTL定义为基因上下游1Mb范围内的SNP，反式eQTL为超出此范围的SNP。显著性阈值设为FDR<0.05。

功能注释与富集分析

利用Ensembl VEP工具注释eQTL功能效应，DAVID进行GO和KEGG通路富集分析。使用GALLO包分析eQTL与AnimalQTLdb中已知QTL的富集情况。

转录因子结合位点分析

通过MEME套件的STREME和TOMTOM工具识别eQTL热点调控基因启动子区的富集motif，并与JASPAR等数据库已知TFBS比对。

遗传参数与GWAS

使用BLUPF90程序基于贝叶方法估计FA性状的遗传力。GWAS模型纳入SNP效应，以SNP p值<0.001为显著阈值。

结果

eQTL识别

共鉴定74,254个显著eQTL，其中顺式eQTL 15,558个（调控1,622个基因），反式eQTL 58,696个（调控10,238个基因），1,202个基因同时受顺式和反式eQTL调控。VEP注释显示40%顺式eQTL和45.8%反式eQTL为新发现变异。顺式eQTL主要位于下游基因区（21.83%）、3'UTR（21.12%）和内含子区（19.63%）；反式eQTL主要位于3'UTR（24.95%）、内含子区（21.41%）和下游区（19.32%）。编码区eQTL中，75%顺式和73%反式eQTL为同义突变，25%顺式和27%反式eQTL为错义突变。

功能富集分析

顺式eQTL调控基因显著富集于124个GO条目，反式eQTL调控基因富集于465个GO条目。KEGG分析显示，反式eQTL基因显著富集于206条通路，包括鞘脂信号通路、脂质与动脉粥样硬化、脂肪酸代谢、脂肪细胞脂解调控等脂质相关通路；顺式eQTL基因未直接富集到脂质代谢通路。QTL注释显示，63.34%顺式和63.10%反式eQTL位于“肉与胴体”相关QTL区间，12.65%顺式和15.10%位于“健康”相关区间。

eQTL热点

共识别23个eQTL热点（平均调控基因数±3倍标准差：>277个），分布在1、2、3、6、8、9、11、12、14和17号染色体。热点SSC3:102983783调控基因最多（4,018个），SSC2:8444101调控最少（287个）。热点SSC14:29337834和SSC12:55140463为错义突变，调控包括LIPE、FASN、ACACA、ACOX1、DGAT1、LIPG、FABP4、FABP3、FABP5、PLA2G7和PLIN2等脂质代谢关键基因。

转录因子识别

Motif分析发现615个显著富集motif（E值<0.05）。与已知TFBS比对后，鉴定出四个脂质代谢相关TF：EGR1、SP1、CREB3和INSM1。这些TF参与AGE-RAGE信号通路（糖尿病并发症）、糖尿病心肌病、皮质醇合成与分泌及TGF-β信号通路等代谢疾病相关通路。

遗传参数与显著SNP

FA性状遗传力估计值为：棕榈油酸0.47±0.10、油酸0.62±0.20、亚油酸0.61±0.20、亚麻酸0.24±0.10、SFA 0.41±0.20、MUFA 0.64±0.20、PUFA 0.64±0.20、n-3 0.43±0.20、n-6 0.62±0.20。GWAS发现两个显著SNP：SSC14:113843655与油酸关联，调控PITX3、NT5C2等4个顺式基因及FTL、GLIS1、API5、HILPDA等20个反式基因；SSC8:38763511与亚麻酸关联，调控顺式基因SLAIN2。

讨论

eQTL与调控机制

本研究鉴定的大量eQTL，特别是反式eQTL，揭示了远端调控在FA代谢中的重要作用。eQTL位于3'UTR等调控区，可能通过影响miRNA结合或mRNA稳定性调控基因表达。QTL富集分析表明eQTL与肉质和健康性状高度相关，凸显FA组成在猪肉品质和人类健康中的重要性。

候选基因功能

eQTL调控的ACACA、FASN、LIPE等基因是脂质代谢关键酶，参与脂肪酸合成与水解平衡。PLA2G7、FABP3/4/5、LIPG、PLIN2等基因与脂肪沉积和FA转运相关，是影响IMF含量的重要候选基因。

转录因子的核心调控作用

识别出的EGR1、SP1、CREB3和INSM1转录因子作为“主调控因子”，通过调控多个下游基因影响脂质代谢通路。EGR1负调控脂肪分化；SP1参与血管生成和脂源性基因调控；CREB3与应激响应和脂肪沉积相关；INSM1通过染色质修饰调控脂肪细胞增殖分化。这些TF在代谢疾病通路中的富集，提示猪作为生物医学模型研究人类代谢疾病的潜力。

遗传背景与育种价值

FA性状中高遗传力表明通过遗传改良改善FA组成的可行性。显著SNP关联的PITX3（肌肉发育）、NT5C2（葡萄糖转运抑制）、FTL（肉色）、GLIS1（成脂分化）、API5（疾病关联）、HILPDA（甘油三酯积累）等基因，为分子育种提供了新靶点。

结论

本研究系统解析了猪骨骼肌FA组成变异的遗传调控网络，鉴定了关键eQTL、热点区域、转录因子及候选基因，为改善猪肉营养品质和利用猪模型研究人类代谢疾病提供了重要理论基础。后续需更大样本验证并探索品种特异性差异。