尼日利亚本土蔬菜种子微生物组揭示植物物种特异性细菌和真菌群落特征及其对可持续农业的启示

本文聚焦于尼日利亚五种重要本土蔬菜（如非洲菠菜、非洲茄子等）的种子微生物组，通过扩增子测序（ASVs分析）和定量PCR（qPCR）技术，揭示了其蕴含的高度多样且丰度显著（细菌108-1011 基因拷贝数/克，真菌109-1011）的细菌（2877个ASVs）和真菌（765个ASVs）群落，并发现这些群落具有显著的植物物种特异性。核心微生物群包含多种潜在有益菌属（如Methylobacterium、Bacillus、Pseudomonas等）和真菌属（如Aspergillus、Fusarium）。研究通过随机森林（Random Forest）分类进一步证实种子微生物谱可有效区分不同植物物种。该研究为理解非洲本土蔬菜的适应性机制及开发基于微生物组的可持续农业策略提供了重要基础。

　　

引言

种子微生物组对于植物健康、发育和适应至关重要。然而，关于非洲本土蔬菜种子微生物组的组成知之甚少，这些微生物组使得特定的微生物遗产能够垂直传播。阐明这一点是当前研究的重点。随着全球人口增长，特别是在撒哈拉以南非洲地区，发展可持续的粮食生产方法变得尤为迫切。该地区的农业系统主要由小农经营，面临着气候变化导致的干旱、病虫害和洪水等挑战，生产力低下。种植生命周期短、对不规则降雨抵抗力更强的本土蔬菜，可以作为保障粮食安全的可靠作物，同时在解决非洲营养不良问题中发挥作用。

这些蔬菜富含蛋白质、微量营养素、维生素并具有抗氧化特性。除了其独特的遗传性状外，植物微生物组在增强植物健康方面的贡献不容低估。在尼日利亚，通过消费本土蔬菜可以缓解营养不良等问题。此外，可食用植物被认为是潜在的益生元/益生菌来源，有助于恢复丢失的微生物组。撒哈拉以南非洲是生物多样性的热点地区，蕴藏着可能增强植物和人类健康的新型益生菌。尽管尼日利亚本土蔬菜的营养和药用重要性日益得到认可，但关于其微生物生态学的数据有限，尤其是种子微生物组。与植物其他部位相比，种子微生物组的研究相对较少，但对于许多非洲作物而言，其种子微生物组的研究仍然匮乏。

植物微生物组（包括细菌、古菌、真菌、病毒等）对植物发育、胁迫耐受和健康至关重要。种子内生菌被认为是植物特异性获取和维持的，它们在植物早期发育和疾病抗性中扮演重要角色。种子是多样化且高度特化的微生物群落的储存库，这些群落在不同植物宿主间差异很大。种子微生物的发生定位于种子组织内部（内生菌）和种子表面（附生菌），其中内生菌构成了垂直传递的种子微生物组的主要部分。本研究旨在探究五种尼日利亚本土蔬菜种子的微生物群落结构和多样性，特别关注微生物群落如何随植物物种变化，以及共享和普遍存在的类群比例。研究假设这些植物的种子微生物组拥有独特的微生物群落，其中关键类群可能对植物健康和恢复力有所贡献。

材料与方法

实验设计与样品材料

研究使用了五种非洲本土蔬菜的种子样品（每种n=6），包括非洲菠菜（Amaranthus hybridus）、非洲茄子（Solanum macrocarpon）、长蒴黄麻（Corchorus olitorius L.）、青葙（Celosia argentea）和西非南瓜（Telfairia occidentalis）。样品购自尼日利亚奥孙州的种子零售店和市场。

样品处理

种子微生物组样品（内生菌和附生菌）的处理在格拉茨技术大学环境生物技术研究所进行。简要流程包括用0.85% NaCl缓冲液轻柔振荡释放种子相关微生物，液氮研磨，离心浓缩微生物沉淀，并储存于-70°C直至DNA提取。

微生物DNA提取与扩增子文库构建

使用FastDNA SPIN Kit for soil提取微生物DNA。通过Nanodrop 2000评估DNA质量。

种子细菌微生物组分析针对16S rRNA基因的V4区，使用引物对515F/806R，并结合肽核酸（PNA）阻断剂以减少质体DNA的共扩增。

真菌群落分析通过扩增ITS片段，使用引物对ITS1f和ITS2r，进行两轮PCR。

古菌群落分析采用巢式PCR，使用古菌特异性引物对344f/915r和修饰后的引物349f/519r。

所有PCR产物经纯化、等摩尔混合后，在Illumina MiSeq平台上进行测序。

实时定量PCR

使用定量PCR量化五种蔬菜物种的微生物丰度。细菌定量使用Unibac-II-515f/806r引物对，古菌使用344aF和517uR引物，真菌使用ITS1f/ITS2r引物。qPCR反应在Rotor-Gene 6000实时分析仪上进行，使用域特异性热循环程序，并通过标准曲线计算基因拷贝数/克样品。

生物信息学数据处理

原始扩增子测序数据使用QIIME2（v2023.9.1）进行处理。流程包括去复用、引物去除、质量过滤、修剪、去噪、合并和去除嵌合体，最终生成扩增子序列变异（ASVs）表。使用SILVA132数据库对细菌和古菌代表序列进行分类学分配，使用UNITE数据库（v7.2）对真菌序列进行分类学分配，均采用VSEARCH算法和0.7的置信度阈值。

统计分析与建模

下游分析在R v4.2.2中进行，主要使用phyloseq、vegan、tidyverse和ggplot2等包。数据过滤以排除非目标类群，并基于总样本0.25%的阈值过滤低丰度ASVs。样本读数通过稀释至最小测序深度（细菌10000，真菌5500，古菌500）进行标准化，用于后续α多样性分析；使用css转换后的非稀释PHYLOSEQ格式数据集进行β多样性分析。

α多样性分析包括计算丰富度（观测ASVs）和香农指数等。使用Kruskal-Wallis检验评估植物物种间α多样性的统计学差异，并进行Dunn's事后检验。

微生物群落结构通过计算Bray-Curtis相异矩阵并进行主坐标分析（PCoA）来检验。通过置换多元方差分析（PERMANOVA，999次置换）检验植物物种对种子细菌组成的影响。通过β离散度检验评估群落组成离散度。

核心微生物组通过计算在25%至100%样本中出现且最小检测阈值在0.00001%至10%之间的类群来确定。使用UpSet图可视化独特和共享的微生物群。

使用RandomForest分类（ntrees=500）识别区分植物物种的重要微生物特征，按平均精度减少值（MeanDecreaseGini）排序呈现前20个特征。

使用FAPROTAX v1.2.10进行原核生物功能预测，使用FUNGuild进行真菌群落功能潜力预测，功能计数数据通过总读数深度标准化后进行热图可视化。

结果

细菌和真菌群落多样性随植物物种变化

经过质量过滤和嵌合序列去除后，细菌群落数据获得2877个细菌ASVs；真菌群落包含765个真菌ASVs；古菌群落由56个ASVs组成。

种子细菌和真菌群落多样性随植物物种变化，观测到的丰富度范围分别为20-610个细菌ASVs和20-120个真菌ASVs，古菌ASVs为2-8个。香农指数（H′）范围分别为细菌1-5，真菌1-3。古菌多样性在各植物物种间基本相似。植物物种间细菌和真菌α多样性存在显著差异，而古菌群落无显著差异。

微生物丰度量化显示，每克种子中细菌标记基因拷贝数为10⁸至10¹¹，真菌为10⁹至10¹¹，古菌为10⁴至10⁷。细菌、真菌和古菌丰度在不同植物物种间均存在显著差异。

主坐标分析表明，微生物组合主要按植物物种区分。植物物种显著影响细菌和真菌群落结构。古菌群落显示出不明确的植物物种依赖性聚类。

细菌群落由620个属、53个纲和27个门组成，主要门为变形菌门（79.9%）、厚壁菌门（11%）、放线菌门（4.9%）和拟杆菌门（3.5%）。真菌群落包含133个属、18个纲和9个门，主要门为子囊菌门和担子菌门。古菌群落包含20个属、5个纲，分布于4个门。

鉴定区分五种非洲本土蔬菜的种子微生物组生物标志物

为了测试种子微生物组是否能区分不同植物物种，应用了预先训练的随机森林分类器对种子微生物群进行重要性排序，以区分植物物种。特定的植物相关细菌属，如Bacillus、Pseudomonas、Acinetobacter、Serratia和Enterobacter，是植物物种的重要区分者。真菌种子微生物群，如与Aspergillus、Eremothecium、Xeromyces、Xerochrysium和Fusarium相关的ASVs，也被发现可以区分不同的植物物种。对于古菌群落，一个属（未培养的Halococcaceae）是不同植物物种的强区分者。

种子微生物群潜在贡献于植物健康的关键作用

为了检验种子微生物组可能贡献的潜在功能，使用了基于分类学的功能分配工具FAPROTAX和FUNGuild分别进行原核生物和真菌功能注释。

主要的细菌功能与化学异养营养相关，这在除Telfairia occidentalis外的所有植物物种中均有观察到。古菌群落功能主要由古菌的甲烷生成相关作用主导，例如利用H2还原CO2产甲烷和氢营养型产甲烷。真菌群落主要由高比例的功能 guild 类别主导，包括内生菌、动物病原菌、植物腐生菌、植物病原菌和木材腐生菌；这些功能在Celosia argentea的种子样品中尤其高。

讨论

本研究探讨了五种非洲本土蔬菜种子的微生物群落，以深入了解其各自的微生物组。它们的微生物组可能包含有益成分，这些蔬菜的恢复力可能归因于此，未来需要更详细地探索。种子微生物组具有植物物种特异性，其特征是细菌和真菌的高度多样性和丰度；尽管古菌种子群落结构较差，多样性也较低。

宿主特异性变异表明宿主遗传可能通过种子化学、物理结构或植物免疫反应影响种子细菌和真菌群落的组装，这些反应选择性地有利于或排除某些微生物群。这一发现与先前评估宿主遗传对栽培和自然种群植物种子微生物组组成影响的研究一致。

所考察蔬菜的种子微生物多样性很高，反映出种子作为全息体的基本单位，代表了植物早期建立所需的微生物的基本部分。特别是对于非洲本土蔬菜，这种微生物群可能在其恢复力中发挥关键作用。此外，种子环境具有支持各种细菌的特定生态位，以便在萌发后延续复杂的植物-微生物相互作用。有趣的是，观察到的高细菌和真菌种子多样性与之前研究的一些高度多样化的植物物种相当。此外，真菌和细菌种子多样性之间存在主要正相关关系。有趣的是，与高微生物多样性相关的植物物种具有较低的微生物丰度。因此，种子微生物丰度可能与多样性呈反比关系。

本研究观察到的种子微生物组组成的基因型特异性早已被多位学者指出。不同植物物种的细菌群落包括几种普遍的细菌属。这些细菌是种子微生物组的普遍成员，正如先前所示。这些细菌也是植物微生物组中有价值的成员，有助于植物抵抗各种胁迫。真菌群落分析揭示了普遍存在的属，这些属通常与种子相关。其中一些属可能是致病性的，但其他如Aspergillus最近被证明对植物健康有益。还观察到某些主要与动物（包括人类）相关的细菌和真菌属的存在。这一观察结果可能是种子处理的结果，或该世界地区种植种子的规格，或可能归因于采后种子管理。

古菌群落的α多样性最低。这种低多样性可能表明古菌群落不是种子微生物组的典型组成部分，而是在植物生长过程中非特异性吸收的。这与在多种作物中显示出良好结构的细菌和真菌群落形成对比。此外，古菌的低丰富度可能反映了它们高度特化的代谢需求和植物相关环境（如种子）中受限的生态位。

我们的结果无法确定种子微生物群的确切作用；然而，通过使用基于分类学的功能预测，我们提供了对这五种非洲蔬菜植物种子微生物群潜在作用的见解。潜在功能主要被归类为 guild，例如细菌、真菌和古菌群落的异养营养、甲烷生成和内生菌。虽然种子细菌功能已被充分研究，但我们尚未理解种子相关古菌的重要性。在本研究中，种子古菌群落功能主要由甲烷生成、硝化作用和硝酸盐还原作用主导；其中Methanobrevibacter、Haloterrigena和Halobaculum是甲烷生成的潜在贡献者。先前的研究表明，古菌可能在促进微生物根系定殖和释放挥发性物质以激活植物系统免疫和防御中很重要。

结论

我们发现种子微生物组随宿主基因型变化，尤其是细菌和真菌群落，古菌群落则非常不特异。鉴于种子在确保植物世代连续性和种子微生物组传播中的核心作用，理解塑造种子微生物群的因素对于设计环境安全的可持续作物改良计划至关重要。此外，越来越多的证据表明特定植物基因（所谓的M基因）在招募和维持植物有益微生物方面的作用，因此可能成为可持续作物育种框架的关键靶点。总体而言，本研究增加了越来越多的证据，表明非洲本土蔬菜蕴藏着多样化的微生物群，为管理各种作物生产胁迫提供了生物资源机会。然而，需要进一步研究来阐明这些多样化微生物群落的功能作用及其对这些重要蔬菜作物生长、产量和恢复力的潜在影响。