基因组编辑抗白叶枯病水稻品种中转基因的去除与产量损失评估

本综述系统评估了通过多重CRISPR/Cas9编辑SWEET基因启动子效应子结合元件(EBE)获得的抗白叶枯病(Xoo)水稻品系。研究证实，经过多代选育的基因组编辑(GE'd)水稻不含外源DNA/转基因片段，符合印度和肯尼亚等国对传统育种系的监管要求。田间试验表明，在无病害压力条件下，编辑品系在农艺性状和产量方面与野生型无显著差异，为这些品系在亚洲和非洲的推广提供了科学依据。

　　

引言

水稻白叶枯病是由稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)引起的重大病害，在非洲和亚洲造成严重产量损失。Xoo通过分泌转录激活样效应子(TALe)蛋白，这些蛋白与SWEET蔗糖单向转运蛋白基因启动子中的效应子结合元件(EBE)结合，诱导宿主SWEET基因表达，这可能是Xoo繁殖和致病所必需的。研究团队通过多重编辑三个SWEET基因(SWEET11a、SWEET13和SWEET14)的EBE区域，阻止TALe结合，从而获得了对多种Xoo菌株具有广谱抗性的基因组编辑水稻品种。

转基因去除与评估

研究团队建立了多层级的转基因评估流程，对编辑后的IR64、Ciherang-Sub1和Komboka品系进行系统分析。评估方法包括PCR检测、DNA凝胶印迹、全基因组测序(WGS)以及国家特定生物安全指南要求的专项测试。

通过PCR筛查，在编辑品系中未检测到CaMV35S启动子、gRNAs、ZmUBI10启动子和Cas9基因片段的扩增产物。DNA凝胶印迹分析使用八个重叠DNA片段作为探针，能够检测到每单倍体基因组中≤0.5个拷贝的载体序列，但在编辑品系中未发现载体序列整合。

全基因组测序分析采用了两种独立的DNA片段化方法（酶切消化和机械剪切）进行短读长测序，并对代表性品系进行了长读长测序。研究人员制定了严格的整合判断标准：映射读数必须为配对读数；嵌合读数中软裁剪部分必须映射到水稻基因组；读数不能对应于载体上的天然水稻来源的U3启动子或EBE序列；映射读数必须在所有生物学重复和两种WGS协议中一致出现。

分析结果显示，大多数编辑品系未检测到载体整合。在IR64-7a品系中发现了来自Cas9的273bp片段插入，但无相邻T-DNA序列。在其他一些品系中检测到的单例读数可能是由索引跳转或污染引起的假阳性。

SNP、Indel和脱靶突变分析

农杆菌介导的水稻转化涉及长时间的组织培养阶段，可能诱导体细胞无性系变异。研究人员通过WGS检测编辑品系中的单核苷酸多态性(SNP)和插入/缺失(Indel)，仅考虑在所有重复和两种WGS协议中一致检测到的共识突变。

在代表性编辑品系IR64-C3中，T1代检测到303个Indel/SNP，经过一次回交后(BC1T3)减少到131个，两次回交后(BC2T5)进一步减少到120个，表明体细胞无性系变异成功减少。观察到的突变数量在自然突变率的预期范围内。

超过75%的SNP位于基因间区，3%-24%位于内含子区，少于10.5%位于外显子区。外显子SNP中大部分为沉默突变或错义突变。在少数品系中发现了导致移码的Indel，但这些突变未对农艺性状产生明显影响。

针对Cas9可能耐受gRNA最多三个错配而导致的脱靶突变，研究人员使用Cas-OFFinder工具进行预测，允许最多五个错配。在编辑品系中检测到的潜在脱靶突变均位于基因间区，且发生概率较低。

满足特定国家监管要求

为满足印度生物技术部(DBT)的要求，研究团队进行了选择标记去除验证和载体序列重叠PCR检测。与含T-DNA的亲本对照不同，编辑品系在含有潮霉素的培养基上不生长，且重叠PCR未产生扩增产物。同时证实编辑的EBE性状可稳定遗传给后代。

这些数据满足了肯尼亚国家生物安全局(NBA)的进口要求，多个编辑品系已被转移到肯尼亚农业和畜牧业研究组织(KALRO)进行种子扩繁和田间试验。

田间农艺性能评估

在菲律宾和哥伦比亚的无白叶枯病压力条件下，研究人员对编辑品系进行了多地点多季节的实验田间plot(EFP)评估。通过无人机多光谱分析，测量归一化差异植被指数(NDVI)和归一化差异红边指数(NDRE)作为冠层发育和叶绿素水平的指标。

在两个种植季节中，编辑品系与野生型在NDVI和NDRE值上无显著差异，表明其光合能力和冠层发育正常。对11个农艺性状的量化分析显示，编辑品系在总体积粒重、每平方米谷物产量、单株谷物产量和每公顷产量等关键指标上与野生型对照无显著差异。

值得注意的是，编辑的IR64品系的千粒重略有降低（降低4%-8%），但总产量未受影响，可能是通过育性和/或小穗数的补偿性增加实现的。主成分分析(PCA)显示，水稻品系的分群主要基于地理和季节因素，而非基因型差异。

在低氮胁迫条件下，编辑品系也表现出与野生型相似的氮利用效率，进一步证实了其田间适应性。

讨论与总结

本研究通过实验室和田间综合分析，为基因组编辑水稻品系向已建立相应监管框架的国家转移提供了科学依据。研究表明，经过精心筛选的编辑品系不含外源DNA/转基因片段，且在不发病条件下不会出现性能缺陷。

全基因组测序被证明是检测转基因整合的可靠方法，特别是长读长测序技术能够提供更高的检测灵敏度。虽然编辑过程中可能引入少量突变，但这些突变大多位于非编码区，对农艺性状影响有限。

研究团队确定了九个适合转移到水稻种植国家的精英品系，这些品系属于三个精英品种，为亚洲和非洲的小规模粮食生产者提供了潜在的抗病解决方案。这些品系的人道主义转移不需要特许权使用费，但可能需要评估知识产权方面的自由实施(FTO)问题。

这项研究为基因组编辑作物在全球范围内的负责任发展和应用建立了重要范例，特别是在解决粮食安全挑战方面具有重要意义。通过符合国家监管要求并提供全面的安全性和有效性数据，这些抗白叶枯病的水稻品系有望为全球水稻生产做出积极贡献。