应用MALDI-TOF MS技术探究真空包装牛肉变色的微生物成因及其对肉品质量的影响

本研究首次系统分析了真空包装牛肉在贮藏过程中发生变色的微生物机制，通过MALDI-TOF MS技术鉴定变色与正常肉样的菌群差异，发现微生物活动并非导致变色的主因，而肌红蛋白氧化（MetMb形成）和肌肉固有特性（如pH和色泽参数L/a）才是关键影响因素。研究为肉类工业中变色问题的控制和品质管理提供了新视角。

　　

2 Materials and Methods

2.1 Sample Preparation

实验样本来自德国专业屠宰场（B?seler Goldschmaus），屠宰流程遵循标准化商业操作。牛只在屠宰前分栏管理以避免相互干扰，采用击晕后悬挂放血处理，胴体分割后于2°C冷库中贮藏约96小时，随后去骨、真空包装并进行湿式熟化。

2.2 Sample Collection

通过为期3周的预实验观察，发现牛肉在去骨线阶段极少出现变色，而真空包装贮藏后（5–8天 post-mortem）才出现显著变色问题。研究在4个月内进行了30次采样，共收集变色样本（n=12）和对照样本（n=12），采样期间平均气温14.5°C，湿度69.6%。样本主要来自臀二头肌（M. gluteobiceps）、阔筋膜张肌（M. tensor fasciae latae）和股外侧肌（M. lateral vastus）。

2.3 Quantitative Microbiological Analysis

依据DIN ISO 4833-2:2022标准，对总需氧菌数（TVC）和厌氧菌数进行定量分析。样本在采集后立即重新真空包装，使用阻隔性材料（聚酰胺/聚丙烯）防止气体交换。变色组和对照组分别于包装后和保质期前进行检测，菌落数以log₁₀ CFU/g表示。

2.4 Qualitative Microbiological Analysis

采用MALDI-TOF MS技术（基于DIN-EN-ISO 16140–4标准）进行微生物种属鉴定，该技术已成功应用于禽肉和羊肉的微生物分析，并与16S rRNA测序结果高度一致。

2.5 Color Measurement

使用ColorLite sph870色度计直接测量肉表色值，包括L（亮度）、a（红度）、b（黄度），并计算色调角（h_a/b）和彩度（C）。测量条件为D65光源，10°视角，校准后取15次读数平均值。

2.6 pH Measurement

采用Testo 205 pH计直接插入肌肉测量，使用pH 4.00和7.00缓冲液校准，每个样本取三点测量均值。

2.7 Statistical Analysis

使用SPSS 23.0进行描述性统计和t检验（显著性水平0.01），并通过Origin Pro进行主成分分析（PCA）和网络图分析（相关系数阈值0.95）。

3 Results and Discussion

3.1 pH Values

对照组pH始终高于变色组，但两者均未达到DFD肉阈值（pH>5.87）。变色组在熟化过程中pH下降0.3单位，可能与乳酸积累有关；而对照组pH上升0.3单位，推测因微生物耗尽糖原后分解氨基酸产生碱性物质（如氨类）。

3.2 Instrumental Meat Color

变色组具有更高L值、更低a值和更高h_a/b值，表明其表面MetMb积累更显著。熟化过程中，对照组L值上升而变色组稳定，可能与pH变化引起的纤维结构变化有关。a值在两组中均下降（约2.7–3.0单位），但变色组a*值始终低于14.5，达到消费者拒购阈值。

3.3 Total Viable Counts

TVC在两组间无显著差异，包装后菌数约为log₁₀ 3 CFU/g，保质期前升至log₁₀ 6 CFU/g，未达到腐败阈值（log₁₀ 7 CFU/g）。表明微生物增长并非变色主因。

3.4 Anaerobic Counts

厌氧菌数在两组间无差异，但在熟化过程中显著增长，真空环境与肉类释放的CO₂促进了厌氧菌增殖。

3.5 Microbial Identification via MALDI-TOF MS

包装后样本菌群多样性较高，以乳球菌（Lactococcus）、假单胞菌（Pseudomonas）、葡萄球菌（Staphylococcus）和不动杆菌（Acinetobacter）为主。变色组独有Macrococcus、Lactobacillus garvieae/sakei、Stenotrophomonas等菌属，对照组则检出大肠杆菌（E. coli）和肠球菌（Enterococcus）。至保质期前，菌群多样性显著降低，以乳酸菌和肠杆菌科为主，但两组核心菌群无本质差异。

3.6–3.8 微生物功能分析

特定菌属（如Serratia、Enterobacter）虽与真空包装腐败（如胀袋）相关，但未发现与变色直接关联。Enterococcus可能产H₂S₂导致绿色变色，但本研究未验证该现象。

3.9 Multivariate Statistical Analysis

PCA显示前三个主成分贡献88.9%方差，L、a、C*对PC1影响最大，TVC和厌氧菌数对PC2影响较小。样本分四类聚集，变色组包装后样本分布集中，对照组保质期前样本分散性高。

3.10 Network Diagram

网络图显示变色组样本相关性更高，对照组样本分布分散，进一步证实两组在理化与微生物指标上的差异。

4 Conclusion

MALDI-TOF MS可有效鉴定真空包装牛肉中的微生物群落，但变色现象主要归因于肌肉生化特性（如氧分压、MetMb还原酶活性）而非微生物活动。未来需结合追溯系统综合分析屠宰前后因素对肉色的影响。

Author Contributions

Alejandro Poveda：课题设计、实验操作、论文撰写；Johannes Krell：数据可视化与修订；Volker Heinz：项目管理与资源支持；Nino Terjung：概念设计、监督与数据分析；Igor Tomasevic：方法论指导；Monika Gibis：资金获取与整体协调。

Acknowledgments

本研究由德国联邦经济事务和能源部（BMWE）通过IGF计划（01IF22142N）资助。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。