酪氨酸代谢工程改造CHO细胞：突破高密度培养限制的新型流加策略

本研究通过系统性代谢工程改造，在重组CHO细胞中过表达QDPR（醌类二氢蝶啶还原酶）协同PCBD1/PAH（蝶呤-4α-甲醇胺脱水酶1/苯丙氨酸羟化酶），重构酪氨酸生物合成通路，成功开发无需碱性酪氨酸补料的流加培养策略，使单克隆抗体（mAb）产量提升33.25%，为高密度细胞培养提供了创新性营养供给解决方案。

　　

Highlight

本研究验证了重组CHO（rCHO）细胞在生长和生产过程中高度依赖外源酪氨酸。多层级表达分析进一步证实低水平的PCBD1/PAH表达限制了内源性酪氨酸合成，并首次发现醌类二氢蝶啶还原酶（QDPR）——一种关键的四氢生物蝶呤（BH₄）再生酶——是此前未被认识的瓶颈环节，尤其在酪氨酸限制条件下。通过在高表达PCBD1/PAH的细胞中共同过表达QDPR以重塑酪氨酸生物合成通路，建立了一种新型流加策略：基础培养基添加3.0 mM酪氨酸+无酪氨酸单次补料培养基。结果显示该策略在高密度流加培养中有效使rCHO细胞最终mAb滴度达到4.24 g/L，相较仅过表达PCBD1和PAH的细胞提高33.25%，较传统策略提高10.70%。

Discussion

酪氨酸在中性溶剂中的低溶解度以及碱性酪氨酸补料引起的pH/渗透压问题，给高密度培养中的酪氨酸供给带来核心挑战。我们的研究表明酪氨酸限制会损害rCHO细胞在不同培养模式下的生长和生产力，当流加培养中基础培养基酪氨酸受限时会造成不可逆伤害。机制上，低PCBD1/PAH表达导致酪氨酸合成缺陷，仅过表达PCBD1/PAH的细胞在酪氨酸限制的流加培养中只能达到部分恢复。值得注意的是，QDPR被鉴定为BH₄再生和持续酪氨酸合成的关键限制因子。通过工程化改造QDPR与PCBD1/PAH协同表达，我们建立了具有完全酪氨酸原养型的新型细胞系，并开发了简化且高效的流加策略。该策略通过消除碱性补料需求显著简化了操作流程，同时通过增强内源性酪氨酸合成维持细胞性能。本研究强调了整体代谢通路优化（而不仅仅是单个酶）在实现高效生物制造中的重要性。

CRediT authorship contribution statement

雷曹：评论修订-编辑，撰写初稿，方法论，研究实施，数据整理，概念化。谈文松：监督指导，项目管理，资金获取，概念化。赵亮：项目管理，概念化。叶倩：评论修订-编辑，概念化。

Declaration of Competing interest

作者声明不存在任何可能影响本研究成果的已知竞争性经济利益或个人关系。

Acknowledgements

本研究未接受任何资助或外部资金支持。

Conflicts of interest

作者声明无利益冲突。