Adapalene通过调控Mst1-Keap1-Nrf2轴缓解神经病理性疼痛的机制研究

本研究针对神经病理性疼痛治疗难题，发现背根神经节中Mst1激酶通过抑制Keap1介导的Nrf2降解，增强抗氧化防御、减轻神经元凋亡，从而缓解疼痛。Adapalene和Chebulic acid分别通过激活Mst1和Nrf2展现治疗潜力，为靶向氧化应激的疼痛治疗提供新策略。

　　

当我们的神经受到损伤时，可能会发展成一种令人困扰的慢性疼痛——神经病理性疼痛。与普通的急性疼痛不同，这种疼痛会长期存在，甚至可能在初始损伤愈合后仍然持续，表现为自发性疼痛、痛觉过敏（对疼痛刺激反应增强）和异常性疼痛（非疼痛刺激引发疼痛）。当前的治疗方法，如阿片类药物、抗抑郁药和抗惊厥药，往往效果有限，且可能伴随耐受性和全身毒性等副作用。因此，探索神经病理性疼痛的根本机制，并寻找新的治疗靶点，成为疼痛研究领域的迫切任务。

近年来，越来越多的证据表明，氧化应激和神经元凋亡是驱动神经病理性疼痛的关键因素。周围神经损伤会导致背根神经节（Dorsal Root Ganglion, DRG）神经元中活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的过量产生，引发脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质氧化。ROS与抗氧化防御之间的失衡会激活细胞凋亡通路，导致神经元丢失和异常疼痛信号传递。因此，阐明氧化应激和细胞凋亡的调控机制，可能为治疗神经病理性疼痛开辟新的途径。

哺乳动物Ste20样激酶1（Mammalian sterile 20-like kinase 1, Mst1）是Hippo信号通路中的一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在脑缺血、心肌梗死和神经退行性疾病的模型中，已被证明参与调节神经元凋亡和氧化应激反应。然而，Mst1在周围神经损伤后背根神经节神经元中的作用尚不清楚。另一方面，Keap1-Nrf2系统是细胞对抗氧化损伤的主要防御机制。在基础状态下，Keap1促进核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）的泛素化和降解；在氧化应激时，Nrf2解离并转入细胞核，诱导血红素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶1（NQO1）等抗氧化基因的表达。Keap1-Nrf2信号失调会导致ROS过度积累、神经元易损性和慢性疼痛表型。Mst1在背根神经节神经元中是否通过Keap1-Nrf2通路调节氧化还原平衡和细胞凋亡，尚未有研究涉及。

为了解答这个问题，发表在《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》上的这项研究，利用两种药理学工具：据报道可激活Mst1/2但也具有维A酸受体活性的Adapalene（ADA），以及能直接激活Nrf2的Chebulic acid，检验了三个假设：（1）周围神经损伤后背根神经节神经元中的Mst1表达下调；（2）这种下调通过破坏Nrf2稳定性、加剧氧化应激和细胞凋亡来促进神经病理性疼痛；（3）恢复Mst1或直接激活Nrf2能产生治疗益处。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，他们建立了小鼠脊髓神经结扎（Spinal Nerve Ligation, SNL）模型来模拟神经病理性疼痛，并通过行为学测试（如冯·弗雷纤毛实验评估机械性异常性疼痛，热辐射实验评估热痛觉过敏）来量化疼痛程度。其次，在分子水平上，他们采用定量实时聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）分别检测了背根神经节和脊髓中Mst1、Keap1、Nrf2等基因的mRNA和蛋白表达水平。此外，还使用了免疫荧光染色技术在背根神经节组织切片上进行Mst1、Nrf2和神经元标志物NeuN的共定位分析。在细胞水平，研究选用了大鼠背根神经元来源的F11细胞系进行体外实验，通过流式细胞术检测了细胞内ROS水平和细胞凋亡情况。药理学干预方面，分别使用了Mst1激活剂Adapalene（ADA）、Mst1抑制剂XMU-MP-1和Nrf2激活剂Chebulic acid进行处理。

3.1. 神经损伤诱导背根神经节（DRG）神经元中Mst1的下调

研究人员发现，与假手术组相比，SNL手术后第5、10和21天，小鼠损伤侧（同侧）L5-L6背根神经节中Mst1的mRNA水平显著降低，而对侧背根神经节与假手术组无显著差异。值得注意的是，在背侧脊髓中，Mst1的mRNA水平在SNL组和假手术组之间没有显著差异，表明Mst1的表达变化特定于受损的背根神经节，而非脊髓。蛋白质印迹分析结果与qPCR数据一致，SNL小鼠同侧背根神经节中Mst1蛋白水平显著低于假手术组和对侧背根神经节，而背侧脊髓的Mst1蛋白水平同样无组间差异。免疫荧光染色进一步在细胞水平证实，在假手术小鼠中，Mst1主要定位于大直径的NeuN阳性背根神经节神经元内；SNL术后，同侧NeuN阳性神经元中的Mst1免疫反应性显著降低，而对侧基本无变化。这些数据共同表明，神经损伤会特异性地下调背根神经节神经元中的Mst1表达。

3.2. ADA通过上调背根神经节中Mst1表达和减少神经元凋亡来缓解神经损伤诱导的疼痛超敏反应

为了验证Mst1下调是否导致疼痛超敏反应，研究者在SNL术后第3天开始，每天口服给予不同剂量（10、50、100 mg/kg）的Mst1激动剂ADA。行为学测试显示，与 vehicle 治疗的SNL小鼠相比，ADA能剂量依赖性地降低机械性异常性疼痛（以缩爪频率PWF衡量）和热痛觉过敏（以缩爪潜伏期PWL衡量）。qPCR和蛋白质印迹分析表明，ADA治疗能显著增加SNL小鼠同侧背根神经节中Mst1的mRNA和蛋白水平，而对侧背根神经节Mst1水平保持稳定。免疫荧光染色结果与之吻合。流式细胞术检测细胞凋亡发现，ADA治疗的SNL小鼠其同侧背根神经节凋亡细胞显著少于 vehicle 对照组，表明ADA诱导的Mst1上调对受损背根神经节具有神经保护作用。这些结果说明，Mst1是神经损伤诱导超敏反应的关键介质，其减少会促进细胞凋亡和疼痛，而ADA恢复Mst1则可减轻细胞凋亡并改善疼痛行为。

3.3. Mst1减少增强背根神经节中Nrf2的降解

为了探究Mst1在氧化应激中的作用，研究使用F11细胞系，并用Mst1抑制剂XMU-MP-1处理。XMU-MP-1有效降低了F11细胞中的Mst1水平。值得注意的是，Mst1抑制显著降低了Nrf2的mRNA和蛋白表达。从机制上讲，XMU-MP-1处理增加了Nrf2的泛素化并加速其降解，提示Mst1通过阻止蛋白酶体降解途径来稳定Nrf2。流式细胞术证实，Mst1抑制导致F11细胞内ROS水平升高。ROS积累是细胞凋亡的已知诱因，流式细胞术也显示XMU-MP-1处理后细胞凋亡增加。这些体外发现与SNL小鼠体内的观察结果相呼应，表明Mst1下调通过增强Nrf2泛素化和降解，削弱抗氧化防御，升高ROS并促进细胞凋亡。

3.4. Mst1通过抑制Keap1介导的Nrf2降解来缓解神经损伤

Keap1-Nrf2通路是细胞防御氧化和亲电应激的核心。Keap1作为E3泛素连接酶，靶向Nrf2进行蛋白酶体降解。蛋白质印迹分析显示，与假手术组和对侧相比，SNL小鼠同侧背根神经节中Keap1蛋白水平显著升高。ADA治疗显著降低了同侧背根神经节中的Keap1水平，同时伴随着Nrf2表达的恢复和氧化应激的减轻，表明Mst1通过抑制Keap1介导的降解来稳定Nrf2。为了验证Nrf2激活的独立作用，研究者用Nrf2激活剂Chebulic acid处理SNL小鼠。qPCR和蛋白质印迹分析证实，Chebulic acid显著增加了同侧背根神经节中Nrf2的mRNA和蛋白水平。免疫荧光染色也显示同侧背根神经节神经元中Nrf2增强。功能上，Chebulic acid减轻了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。流式细胞术进一步显示，治疗组同侧背根神经节细胞内ROS水平降低，神经元凋亡减少。这些结果共同表明，Mst1通过抑制Keap1稳定Nrf2，增强抗氧化防御，减少ROS，防止神经元凋亡，从而缓解神经损伤。

本研究证实Mst1在神经病理性疼痛中通过调节背根神经节内的Keap1-Nrf2信号级联发挥关键的神经保护作用。Mst1的激活促进了Nrf2的稳定，增强了抗氧化防御，减轻了氧化应激和神经元凋亡；而抑制Mst1则加剧疼痛反应和神经元损伤。药理学增强Mst1（使用ADA）可缓解疼痛行为并减少氧化损伤，直接激活Nrf2（使用Chebulic acid）则能绕过上游调控，强力增强抗氧化防御。

这项研究的意义在于，它首次揭示了Mst1在神经病理性疼痛背景下对背根神经节Keap1-Nrf2通路的调控作用，提出了一个 previously unrecognized 的Hippo-Keap1-Nrf2轴。这为理解神经损伤后氧化应激的调控提供了新的机制见解。针对Mst1-Nrf2轴的干预策略，特别是ADA展现的治疗潜力，为开发超越症状缓解、具有疾病修饰潜力的神经病理性疼痛疗法提供了新的思路和靶点。当然，该研究也存在一些局限性，例如使用的药理学工具（如ADA）可能存在脱靶效应，未来需要更特异性的工具和遗传学模型来进一步验证机制。此外，Mst1-Nrf2信号的下游效应器以及该轴在其他疼痛相关脑区的作用也有待探索。尽管如此，这项研究为应对难治性神经病理性疼痛这一临床挑战提供了有希望的新方向。