侧柏叶乙酸乙酯组分通过Raf/MEK1/2和AKT1/mTOR信号通路抑制高糖诱导的人视网膜内皮细胞新生血管生成和血管生成的作用及机制研究

本研究针对糖尿病视网膜病变中病理性新生血管生成这一难题，探讨了侧柏（Platycladus orientalis）乙酸乙酯组分（POEA）的抗血管生成潜能。研究人员发现POEA能有效抑制高糖应激下人视网膜内皮细胞（HRECs）的迁移和微管形成，并证实其通过下调VEGF/VEGFR2信号轴，同时调控下游AKT1/mTOR与Raf-1/MEK1/2通路，发挥抗新生血管生成作用。该研究为糖尿病视网膜病变提供了基于天然产物的潜在治疗策略，具有重要的转化医学价值。

　　

糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是工作年龄成年人致盲的主要原因。其晚期阶段——增殖性糖尿病视网膜病变的特征是视网膜表面形成脆弱易出血的新生血管，这些异常血管可破坏视网膜结构，损害血-视网膜屏障，并导致视网膜血管稳态失衡。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）是这一过程中的关键促血管生成因子，它通过激活VEGF受体2（VEGFR2），进而触发包括丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin, mTOR）和快速加速纤维肉瘤-1（Rapidly Accelerated Fibrosarcoma-1, Raf-1）/丝裂原活化细胞外信号调节激酶1和2（Mitogen-activated Extracellular signal-regulated Kinase 1/2, MEK1/2）在内的多条信号通路，共同促进内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，最终驱动病理性视网膜新生血管生成和血管通透性增加。目前，靶向VEGF的抗血管生成药物是治疗DR的主要手段，但仍存在治疗抵抗、复发以及潜在副作用等问题。因此，探索能够多靶点干预关键信号通路的新型治疗策略，尤其是从天然产物中寻找有效成分，具有重要的临床意义和应用前景。

在此背景下，侧柏（Platycladus orientalis (L.) Franco）作为一种传统中药，因其凉血止血的功效而被记载于《神农本草经》。现代药理学研究进一步发现其具有抗高血糖、抗炎和抗血管生成等多种活性。然而，其对人视网膜内皮细胞（Human Retinal Endothelial Cells, HRECs）的具体作用及其在糖尿病视网膜病变相关新生血管生成中的调控机制尚不明确。为此，研究人员在《Life Sciences》上发表了该项研究，旨在评估侧柏乙酸乙酯组分（P. orientalis Ethyl Acetate fraction, POEA）的细胞毒性作用，并深入阐明其抗新生血管生成和抗血管生成活性的内在分子机制。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先通过液相色谱-质谱联用（LC-QqQ-MS）技术鉴定POEA中的植物化学成分；采用MTT法检测POEA对在不同葡萄糖浓度（5.5 mM, 25 mM, 50 mM）下培养的HRECs的细胞毒性和细胞活力；通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）分别从基因和蛋白水平检测血管生成相关标志物（VEGF、VEGFR2、AKT1、mTOR、Raf-1、MEK1、MEK2）的表达；最后利用细胞划痕实验和Matrigel微管形成实验评估POEA对HRECs迁移和成管能力的影响。

3.1. POEA中的植物化学成分

研究通过LC-QToF-MS分析，从POEA中鉴定出7种主要植物化学成分，归属于5大类：单萜酯（4Z-癸烯乙酸酯，1.88%）、二萜类（ Ferruginol 1.31%，Isosteviol methyl ester 0.97%，Thunbergol 0.35%）、饱和脂肪酸（2R-羟基月桂酸，0.97%）、酚苷（Sphalleroside A，0.78%）和叶绿素衍生物（2,6-壬二烯-1-醇，0.44%）。这些成分，尤其是单萜酯和二萜类，被认为是其发挥药理活性的物质基础。

3.2. POEA在高糖应激下对HRECs的细胞保护作用

形态学观察发现，高糖（25 mM和50 mM）会导致HRECs失去其典型的鹅卵石形态，变得收缩、簇集，并形成更复杂的网络结构（网格尺寸、片段和节点数增加）。POEA处理能部分恢复细胞的正常形态，并减小高糖诱导的网格尺寸。细胞毒性试验表明，POEA对HRECs的半数抑制浓度（IC₅₀）为0.413 mg/mL，在0.125 mg/mL及以下浓度时，能维持细胞活力在80%以上。在高糖应激下，POEA处理能显著恢复HRECs的活力，表现出剂量和时间依赖性的细胞保护作用。

3.3. 葡萄糖应激和POEA对HRECs新生血管生成和血管生成基因标志物的影响

高糖应激显著上调了HRECs中促血管生成基因的表达。与正常葡萄糖（5.5 mM）对照组相比，25 mM和50 mM葡萄糖分别使VEGF基因表达上调了7.12和15.76倍，VEGFR2上调了7.84和15.01倍，mTOR上调了3.45和7.36倍，Raf-1上调了5.45和10.12倍，MEK1上调了4.66和11.22倍，MEK2上调了4.25和11.35倍。相反，AKT1的表达则被下调。POEA处理能剂量依赖性地显著下调这些因子的基因表达水平（除AKT1被上调恢复外），使其恢复至接近正常葡萄糖对照组的水平，而在正常葡萄糖条件下，POEA对这些基因的表达无显著影响。

3.4. 葡萄糖应激和POEA对HRECs新生血管生成和血管生成蛋白标志物的影响

蛋白质水平的结果与基因表达趋势一致。高糖应激显著增加了VEGF、VEGFR2及其磷酸化形式（phospho-VEGFR2）、mTOR (phospho-mTOR)、Raf-1 (phospho-Raf-1)、MEK1/2 (phospho-MEK1/2) 的蛋白表达，并降低了AKT1 (phospho-AKT1) 的表达。POEA处理能剂量依赖性地抑制这些蛋白的表达（VEGF、VEGFR2、mTOR、Raf-1、MEK1/2及其磷酸化形式），并恢复AKT1及其磷酸化形式的表达。值得注意的是，POEA对在正常葡萄糖条件下培养的HRECs的这些蛋白表达没有显著影响，表明其作用具有选择性。

3.5. POEA与实验对照组联合治疗的协同抗新生血管生成和抗血管生成作用

功能实验表明，高糖应激和VEGF刺激能显著促进HRECs的迁移和微管形成。POEA处理能剂量依赖性地抑制这两种过程，其效果与MEK1/2抑制剂U0126相当。更重要的是，POEA与U0126联合使用时，表现出协同抑制效应，能更有效地抑制细胞迁移和微管形成。POEA还能有效减弱VEGF诱导的血管生成。

研究结论与意义

本研究得出结论：侧柏乙酸乙酯组分（POEA）能有效抑制高糖诱导的人视网膜内皮细胞（HRECs）的新生血管生成和血管生成过程。其作用机制是通过多靶点调控VEGF/VEGFR2信号轴及其下游的AKT1/mTOR和Raf-1/MEK1/2信号通路来实现的。具体表现为：POEA下调VEGF、VEGFR2、mTOR、Raf-1、MEK1/2的表达和活化，同时恢复AKT1的存活信号通路，从而综合抑制内皮细胞的迁移和成管能力。

该研究的重要意义在于：首先，它从天然植物侧柏中发掘出具有抗糖尿病视网膜病变潜力的活性组分，为开发新型治疗药物提供了候选物质和理论依据。其次，研究阐明了POEA多通路、多靶点的作用机制，这不仅优于单一靶点药物，也可能有助于克服现有抗VEGF治疗的耐药性问题。最后，这些发现为将传统中药应用于现代疾病治疗，特别是糖尿病微血管并发症的防治，提供了重要的实验数据和支持，具有潜在的转化价值和临床应用前景。未来的研究可集中于分离鉴定POEA中的具体活性单体成分，并在体内动物模型（如糖尿病小鼠模型）中进一步验证其疗效和安全性。