钙镁离子通过膜保护与代谢调控提升保加利亚乳杆菌喷雾干燥存活率的机制研究

本期推荐：研究针对喷雾干燥过程中益生菌存活率低的问题，探讨了Ca2+和Mg2+对Lactobacillus bulgaricus的保护机制。结果表明，这两种离子通过上调脂肪酸代谢和糖酵解通路关键基因、增强Ca2+/Mg2+ ATPase活性、减少膜脂氧化和膜电位去极化，显著提高菌体存活率和膜完整性，为益生菌制剂工业化生产提供了有效策略。

　　

随着全球益生菌市场的迅猛扩张，消费者对具有健康促进作用的活性微生物产品的需求日益增长。据预测，到2030年，该市场规模将以年均14.1%的复合增长率持续增长，市场规模预计将达到877亿美元。在食品工业中，乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）作为最常见的益生菌，尤其是乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium），因其对胃肠道健康、免疫调节及抗菌活性的积极作用而被广泛应用。然而，益生菌在生产过程中面临着一个关键挑战：如何在高强度加工条件下维持其存活率和功能活性。

目前，冷冻干燥被视为益生菌保存的“金标准”，因其能获得较高的存活率。但该方法能耗大、成本高，限制了其大规模工业应用。真空干燥同样存在耗时、费用高昂的问题。相比之下，喷雾干燥具有可连续操作、成本低、效率高的优势，更适合于工业化生产。然而，喷雾干燥过程中细菌需经历快速脱水、高温和氧化应激，这些应激因素会导致细胞膜损伤、蛋白质变性和代谢途径中断，特别是对热敏感菌株如保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）而言，存活率往往大幅降低。

现有的保护策略，如微胶囊化和糖类保护剂，虽能在一定程度上减轻脱水损伤，但无法全面应对多种应激源，尤其是热和氧化损伤。因此，探索能够从根本上增强菌体抵抗力的方法显得尤为重要。近年来，二价阳离子如钙（Ca²⁺）和镁（Mg²⁺）在细菌应激保护中的作用逐渐受到关注。这些离子不仅参与膜稳定和酶活性调节，还在能量代谢和氧化平衡中发挥关键作用。例如，已有研究表明，Mg²⁺的添加可使Lactobacillus rhamnosus GG在热处理中的存活率提高100倍；类似地，Ca²⁺的积累也能显著增强菌体的热稳定性。然而，这些保护作用的具体分子机制，尤其是在喷雾干燥这种多因素应激条件下的调控网络，尚缺乏系统深入的研究。

为此，来自哈尔滨工业大学的研究团队在《LWT》期刊上发表了一项研究，旨在揭示Ca²⁺和Mg²⁺在喷雾干燥过程中通过膜保护和代谢调控提升保加利亚乳杆菌存活率的机制。该研究不仅从生理指标层面验证了这两种离子的保护效果，还借助蛋白质组学、分子生物学及生物化学技术，从基因表达、酶活性、膜特性及能量代谢等多角度阐明了其作用途径。

为开展本研究，作者主要应用了以下关键技术方法：首先，通过TMT（Tandem Mass Tag）标记的定量蛋白质组学分析，比较喷雾干燥前后菌体内差异表达蛋白，并利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）进行通路富集分析；其次，采用RT-qPCR（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction）验证关键基因的表达变化；第三，通过测定ATP酶活性、细胞内ATP水平、膜电位（使用DiBAC₄(3)染色）、膜完整性（PI染色）及氧化指标（ROS、MDA、T-AOC）评估细胞应激状态；第四，利用气相色谱分析脂肪酸组成变化；最后，通过统计学方法对实验数据进行显著性检验。所有实验均设置三次独立重复，以确保结果的可靠性。

研究结果部分如下：

3.1. TMT-based proteomic analysis

蛋白质组学分析显示，喷雾干燥后保加利亚乳杆菌的脂肪酸代谢和糖酵解途径严重受损。KEGG富集分析表明，差异表达蛋白主要富集于脂肪酸生物合成和ABC转运蛋白等通路。GSEA进一步证实，糖酵解和磷酸戊糖途径相关蛋白显著下调。这些结果提示，喷雾干燥导致菌体能量代谢紊乱和膜功能异常。

3.2. The optimum concentration of Ca²⁺ or Mg²⁺

通过测定不同浓度离子处理后的菌体存活率，发现添加20 mmol/L Mg²⁺或10 mmol/L Ca²⁺时，喷雾干燥后的存活率最高（分别达43.27%和43.06%），同时Ca²⁺/Mg²⁺ ATPase活性显著增强。这表明适量离子补充可有效提升菌体干燥抗性。

3.3. Membrane potential and ATP

膜电位和膜完整性检测表明，喷雾干燥导致细胞膜显著去极化和损伤，细胞内ATP水平下降。而离子处理组（Mg²⁺或Ca²⁺）的膜电位去极化程度减轻，膜完整性改善，ATP含量提高至对照组的1.86–2.08倍。证明这两种离子通过维持膜稳定和能量稳态增强菌体存活。

3.4. Cell membrane permeability and lipid oxidation

离子处理还显著增强了菌体对渗透压和胆汁盐的耐受性，降低了细胞内ROS和MDA水平（脂质氧化减少18–22%），提高了总抗氧化能力（T-AOC）。脂肪酸组成分析进一步显示，离子处理增加了不饱和脂肪酸（如C16:1和C18:1）的比例，维持了膜流动性，从而缓解了氧化损伤。

综上所述，本研究系统阐述了Ca²⁺和Mg²⁺通过多重机制增强保加利亚乳杆菌喷雾干燥抗性的作用：一方面，它们上调了脂肪酸代谢和糖酵解相关基因表达，促进能量生成；另一方面，通过激活Ca²⁺/Mg²⁺ ATPase、减少膜脂氧化和膜电位去极化，维护膜完整性和功能；同时，离子处理还增强了细胞的抗氧化能力，减少ROS累积。这些效应协同作用，最终显著提高了菌体的存活率。

该研究的结论强调，在喷雾干燥过程中添加适量Ca²⁺（10 mmol/L）或Mg²⁺（20 mmol/L）是一种简单、有效的策略，可显著改善益生菌制剂的工业生产稳定性和应用潜力。未来研究可进一步探索这些离子在其他益生菌株和保护性工艺中的推广应用，并深入解析其分子调控网络，为食品微生物技术和益生菌制剂开发提供理论依据和实践指导。