基于吩噻嗪和吩噁嗪的高光稳定性、大斯托克斯位移免洗荧光探针用于亚细胞器靶向成像

本研究针对传统细胞器靶向探针需洗涤去除多余染料以增强信噪比，但可能造成细胞损伤并干扰连续观察的问题，开发了一系列基于小分子吩噻嗪(PTZ)/吩噁嗪(PXZ)的免洗探针。通过硝基修饰增强其极性敏感特性，这些探针具有分子量小、光稳定性优异、斯托克斯位移大(高达191 nm)等优点。结合靶向基团，实现了对溶酶体、线粒体、内质网、脂滴和质膜等多种细胞器的免洗特异性成像，并成功应用于活细胞内脂滴动态变化的实时监测，为实时、多细胞器成像提供了新策略。

　　

在生命科学研究中，荧光成像技术如同一双明亮的“眼睛”，让科学家得以窥见细胞内部的精细结构和动态过程。这项技术凭借其非侵入性、高时空分辨率和卓越的灵敏度，已成为生物医学研究不可或缺的工具。然而，作为成像系统核心的荧光探针，其性能直接影响着观测结果的清晰度和可靠性。一个理想的探针通常需要具备优异的生物相容性、低细胞毒性、高光稳定性、良好的溶解性以及大的斯托克斯位移（Stokes shift，即激发波长与发射波长之差）。尤为关键的是，它需要能够特异性地靶向到特定的亚细胞器或结构，并且最好能够兼容“免洗”（wash-free）的成像流程。

传统的细胞器靶向探针常常面临一个尴尬的境地：它们进入细胞后，会与细胞内多种组分发生非特异性相互作用，导致强烈的背景荧光，严重降低了成像的信噪比和质量。为了解决这个问题，研究人员通常需要在成像实验前，通过反复洗涤的步骤来去除未结合或非特异性结合的过量染料。这个看似简单的操作却暗藏玄机：它不仅耗时费力，更可能对脆弱的细胞造成机械损伤，甚至干扰细胞正常的生理活动，使得对细胞动态过程的连续观察变得困难重重。因此，开发无需洗涤步骤即可实现高对比度、特异性成像的荧光探针，成为了该领域一个重要的挑战。

针对这一挑战，目前主流的免洗探针主要依靠两种机制发挥作用。一种是“反应激活型”，即探针与靶标生物分子发生反应后，其结构和光物理性质发生改变，从而产生荧光信号放大。另一种是“环境敏感型”，这类探针本身荧光很弱，但其荧光特性（如强度、波长）会随着所处微环境（如极性、粘度、温度等）的变化而显著改变。其中，极性敏感型探针尤其适用于活细胞免洗成像，因为细胞内部本身就存在着极性分布的异质性——亲水性的细胞质（高极性）和疏水性的细胞器内部（低极性）形成了天然的对比度。大多数极性敏感探针采用给体-受体（D-A）结构，通过分子内电荷转移（ICT）效应产生溶致变色效应，即在极性高的溶剂中荧光淬灭，在极性低的溶剂中荧光增强。

尽管已有一些基于吩噻嗪（Phenothiazine, PTZ）等强电子给体的免洗探针被报道，但许多分子存在合成路线复杂、或使用带电基团作为受体/给体来增强ICT效应和扩展发射光谱的问题。带电的荧光团往往会导致细胞通透性差，或容易与细胞膜相互作用，降低细胞存活率，或特异性聚集在线粒体，难以靶向其他细胞器。因此，开发分子量小、合成简便、能靶向多种细胞器且性能优异的免洗探针仍然是一个有待突破的方向。

在此背景下，发表在《Materials Today Bio》上的一项研究为我们带来了新的解决方案。由澳门大学健康科学学院的张宣军教授团队完成的研究，成功设计并合成了一系列基于吩噻嗪（PTZ）及其类似物吩噁嗪（Phenoxazine, PXZ）骨架的新型免洗荧光探针。这些探针巧妙地利用了硝基修饰来增强极性敏感性，并通过对吩噻嗪/吩噁嗪母核进行简单的功能化，实现了对多种亚细胞器的特异性靶向和免洗成像。

研究人员主要运用了有机合成化学方法构建了PTZ和PXZ系列的探针分子，通过核磁共振（NMR）和质谱（MALDI-TOF）进行结构表征。利用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱系统评估了探针的光物理性质（吸收/发射波长、斯托克斯位移、量子产率、荧光寿命）。通过密度泛函理论（TD-DFT）计算分析了分子的几何构型和前沿分子轨道分布。在细胞水平，使用HeLa细胞和SKOV3细胞，通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法评估了探针的细胞毒性和光毒性。最关键的是，采用共聚焦显微镜成像技术，在免洗条件下进行了探针的细胞器共定位实验（与商品化线粒体、内质网、溶酶体、脂滴、细胞膜探针对比），并利用Pearson相关系数（Pr）量化共定位程度。此外，还进行了光漂白实验评估探针的光稳定性，并使用线粒体膜电位抑制剂FCCP验证了线粒体靶向探针的膜电位依赖性。最后，利用PXZ-Lipid探针实时监测了油酸（OA）诱导的SKOV3细胞中脂滴（LDs）的动态变化过程。

3.1. 探针的设计与合成

研究团队以吩噻嗪作为强电子给体，通过在芳香环上引入强吸电子基团硝基，构建了给体-受体（D-A）型氟团。进一步，在吩噻嗪母核两侧均引入硝基，形成了受体-给体-受体（A-D-A）型氟团。为了实现细胞器靶向，研究人员在氮原子上引入了连接长烷基链的溴原子，合成了中间体2a和2b。同时，通过引入叔丁氧羰基（Boc）基团合成了中间体3a和3b，这显著增强了探针与脂滴的亲和力。光物理测试表明，这些中间体在四氢呋喃（THF，低极性）和甲醇（高极性）中吸收强度相似，但荧光强度差异巨大，在THF中发射强烈，在甲醇中几乎无荧光，证明了其显著的溶致变色行为。研究还指出，探针的亲疏水平衡对其靶向不同细胞器至关重要。通常，高亲脂性探针易于穿过质膜并积累在溶酶体、线粒体、内质网和脂滴等细胞器中，而质膜靶向探针则通常采用两亲性设计。基于此，研究人员将不同的细胞器靶向基团与吩噻嗪氟团骨架连接，开发出了一系列新型的极性敏感且细胞器特异性的荧光探针。

3.2. 吩噻嗪基探针的光物理性质

在THF中测试了吩噻嗪基分子的光物理性质。PTZ系列探针（PTZ-Lyso, PTZ-Mito, PTZ-Memb, PTZ-ER, PTZ-Lipid）的最大吸收/发射峰分别位于424/613 nm, 428/619 nm, 427/607 nm, 429/588 nm, 和423/610 nm。PTZ2N系列（双硝基）的最大吸收峰相较于PTZ系列普遍红移，但发射峰则发生蓝移，这可能源于两个硝基在激发态对ICT效应的竞争导致电荷转移分散。所有分子在THF中均表现出大的斯托克斯位移（146 nm至191 nm）。在不同极性溶剂（甲苯、THF、丙酮、甲醇）中的荧光光谱测试表明，所有分子均表现出显著的溶剂化效应：在低极性甲苯中荧光最强，在高极性甲醇中几乎完全淬灭，且最大发射峰随溶剂极性增加而红移，证实了其ICT性质和极性敏感特性，适用于免洗活细胞成像。光稳定性测试显示，吩噻嗪系列探针在氙灯照射下几乎不分解，远优于商业染料荧光素。细胞毒性（CCK-8法）和光毒性评估表明，除线粒体靶向探针（PTZ-Mito, PTZ2N-Mito）在较高浓度下因阳离子靶向基团与细胞膜相互作用导致细胞活力下降外，其他探针在1-8 μM浓度范围内均表现出良好的生物相容性（细胞活力 >85%）和低光毒性。

3.3. 活细胞中细胞器的共聚焦成像

在免洗条件下评估了PTZ2N系列探针在活HeLa细胞中的定位能力。共定位实验显示，PTZ2N探针（红色通道）与商品化细胞器探针高度重合：PTZ2N-Mito与MitoTracker-Green (Pr = 0.96), PTZ2N-ER与ERTracker-Green (Pr = 0.93), PTZ2N-Lyso与LysoTracker-Green (Pr = 0.92), PTZ2N-Lipid与BODIPY 493/503 (Pr = 0.90), PTZ2N-Memb与细胞膜染料 (Pr = 0.84)。与非对应商品化探针的低Pr值进一步证实了其优异的特异性。PTZ系列探针也表现出类似的优异靶向性能（Pr 0.84-0.96）。光漂白实验表明，PTZ2N-Mito和PTZ-Mito在488 nm激光连续照射30分钟下，比商品化MitoTracker-Green具有更强的抗漂白能力。使用线粒体膜电位解偶联剂FCCP处理细胞后，PTZ2N-Mito的荧光强度随膜电位降低而减弱，证明其靶向依赖于线粒体膜电位。

3.4. 吩噁嗪基探针的光物理性质

受吩噻嗪基探针成功的鼓舞，研究团队将相同策略应用于吩噁嗪（PXZ），合成了PXZ-Lyso, PXZ-Mito, PXZ-ER, PXZ-Lipid, PXZ2N-ER和PXZ2N-Lipid等探针。吩噁嗪基探针同样表现出明显的极性敏感行为。在THF中，PXZ系列的最大吸收/发射峰分别为：PXZ-Lyso (454/585 nm), PXZ-Mito (458/589 nm), PXZ-ER (443/576 nm), PXZ-Lipid (436/575 nm)。双硝基取代的PXZ2N系列也表现出吸收红移和发射蓝移的现象。与PTZ衍生物相比，PXZ衍生物的吸收峰明显红移，发射峰蓝移，导致斯托克斯位移减小（82–139 nm）。理论计算（TD-DFT）显示，由于中心氧原子的空间位阻更小，PXZ分子比具有“蝴蝶状”构象的PTZ分子更平面，共轭更有效。HOMO轨道在PXZ骨架上离域更广，而PTZ的HOMO则更局域在中心三环和硫原子上。所有分子的LUMO都主要定位于硝基取代的芳香环，支持了激发态下的ICT转变。

3.5. 吩噁嗪基探针的细胞成像

吩噁嗪基探针也表现出优异的生物相容性和低光毒性。共定位成像显示，PXZ-Mito与MitoTracker-Red (Pr = 0.90), PXZ-ER与ERTracker-Red (Pr = 0.91), PXZ-Lyso与LysoTracker-Red (Pr = 0.91), PXZ-Lipid与BODIPY 493/503 (Pr = 0.92), PXZ2N-ER与ERTracker-Red (Pr = 0.94), PXZ2N-Lipid与BODIPY 493/503 (Pr = 0.92)均高度共定位。PXZ系列探针同样表现出优异的光稳定性。基于PTZ系列（红色发射）和PXZ2N系列（绿色/黄色发射）探针发射波长的差异，研究人员成功在免洗条件下实现了活HeLa细胞的双色成像，例如同时观察内质网和溶酶体，或脂滴与线粒体/溶酶体的空间分布，提高了成像效率和信号区分度。

3.6. 活细胞中脂滴动态变化的原位监测

脂滴（LDs）是动态的多功能细胞器。凭借优异的光稳定性，PXZ-Lipid被选用来监测SKOV3细胞中LDs的动态行为。通过先饥饿处理耗尽内源性LDs，然后加入PXZ-Lipid和油酸（OA）诱导LDs形成，研究人员对同一区域进行了连续观察。ImageJ软件分析显示，OA刺激后，LDs的数量和大小均发生显著变化：初始（0分钟）约有143个小LDs；OA刺激后数量急剧增加，在8分钟时达到峰值约431个；随后数量逐渐下降，在24分钟后稳定在约340个。与此同时，LDs的尺寸显著增大，表明可能存在小脂滴融合或聚集形成大脂滴的过程。这证明了PXZ-Lipid能够高分辨率、实时地追踪LDs的形成和形态演变。

该研究成功开发了一系列基于吩噻嗪和吩噁嗪骨架的免洗、细胞器特异性荧光探针。这些探针通过巧妙的硝基修饰增强了极性敏感性，具备分子量小、光稳定性高、斯托克斯位移大等突出优点。研究系统地证实了它们在免洗条件下对多种亚细胞器（溶酶体、线粒体、内质网、脂滴、质膜）的特异性靶向能力，并展示了其在双色成像和实时动态监测（如脂滴变化）中的应用潜力。理论计算深入揭示了PTZ和PXZ分子在几何结构和电子特性上的差异，为其不同的光物理行为提供了合理解释。这项工作不仅为解决传统探针需洗涤、背景高、可能干扰细胞活动的问题提供了有效的工具，更重要的是，它提出了一种基于PTZ/PXZ骨架设计小分子免洗荧光探针的通用策略。这种策略为实时、多细胞器、低干扰的活细胞成像研究开辟了新的途径，对推动细胞生物学、疾病机制研究和药物筛选等领域的发展具有重要意义。