基于多重RT-RPA-LFD技术同步快速可视化检测三种甘蔗花叶病毒的现场应用研究

本研究针对甘蔗花叶病毒田间快速检测难题，开发了一种基于多重逆转录重组酶聚合酶扩增-侧向流动层析（mRT-RPA-LFD）的技术平台，实现了SrMV、SCMV和SCSMV三种病毒的同步、快速、可视化检测。该方法无需复杂设备，16分钟即可完成检测，灵敏度高达10 fg/μL，为甘蔗病毒病的现场防控提供了高效技术支撑。

　　

甘蔗作为全球重要的糖料和能源作物，在热带和亚热带地区广泛种植。然而，在其生长过程中极易受到多种病毒的侵染，如高粱花叶病毒(SrMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)、甘蔗黄叶病毒(SCYLV)和甘蔗杆状病毒(SCBV)等。其中，SrMV和SCMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，而SCSMV属于同一科的禾草病毒属(Poacevirus)。这三种花叶病毒引起的甘蔗花叶病导致严重的产量和品质损失。值得注意的是，病毒症状仅在严重感染的植株上可见，而一些受感染植株由于复杂的环境或营养条件可能保持无症状状态。此外，甘蔗容易受到多种病毒的混合侵染，这给病毒检测带来了重大挑战。

目前，控制甘蔗病毒病的关键措施是培育无病毒健康种苗，而早期准确的病毒检测在病原管理中起着关键作用。虽然已有许多检测甘蔗病毒的方法被报道，如RT-PCR、qRT-PCR、多重RT-PCR、免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)等，但这些方法存在耗时长、需要专用实验室设备和检测灵敏度不一等缺点，限制了它们的大规模田间应用。

等温扩增是一种在恒定温度下快速高效扩增核酸的简单过程，不需要热变性过程，非常适合使用便携式加热设备进行现场检测。这些技术主要包括链置换扩增(SDA)、交叉引物扩增(CPA)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、解旋酶依赖性等温DNA扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等。其中，RPA assay在恒定温度(22-45°C)下启动指数级DNA扩增，可在20分钟内完成。它涉及重组酶、DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白与引物和靶序列的相互作用。RPA以其简单性、高灵敏度、特异性、多重检测兼容性、极快的扩增速度和恒定温度操作而著称。

准确且易于解释的结果对于分析扩增产物至关重要，凝胶电泳、荧光标记和侧向流动免疫层析分析等技术被广泛用于分析RPA产物。其中，RPA与侧向流动试纸条(LFD)结合可在5-10分钟内实现视觉、半定量读数，避免了复杂仪器的使用。由于其简单、快速和准确的特点，RPA-LFD及其衍生技术已迅速应用于各种动植物病毒的检测。

随着基于纤维素试纸条的核酸提取方法的发展，核酸提取过程已显著缩短至不到30秒。在这项研究中，我们将这种提取方法与多重RT-RPA和LFD(mRT-RPA-LFD)相结合，快速同时检测SrMV、SCMV和SCSMV，适用于田间应用且不依赖实验室设备。结果仅需16分钟即可获得，建立了一站式快速现场检测系统。这为田间快速、大规模、可视化检测甘蔗病毒提供了高效工具，支持甘蔗花叶病的有效管理。

研究人员采用了几项关键技术方法开展本研究：首先使用Whatman No.1纤维素滤纸建立30秒快速核酸提取方法；针对SrMV、SCMV和SCSMV保守基因组区域设计特异性RPA引物和探针；建立多重RT-RPA反应体系并优化引物/探针浓度比例；开发三重靶标核酸检测试纸条实现可视化检测；使用保温杯等简单设备构建现场检测平台。研究使用的149份甘蔗病毒样品来自广西主要蔗区及其他国内甘蔗种植区。

2.1. 甘蔗快速核酸提取的效果

通过将Whatman No.1纤维素滤纸预切成22mm×2mm的条带，建立了四步核酸提取协议：15秒缓冲液裂解、3秒浸泡在匀浆混合物中、3秒缓冲液洗涤和最后4秒在PCR反应混合物中洗脱。整个过程在30秒内完成，产生适合快速现场检测的粗模板。所有使用试纸方法制备的模板都具有良好的模板质量和明显的条带。

2.2. mRT-RPA-LFD检测甘蔗花叶病毒的原理

mRT-RPA-LFD的关键优势在于通过将mRT-RPA扩增与基于胶体金的双抗体夹心法相结合，在单个反应中实现快速、多重可视化结果。通过将RPA扩增产物滴加到胶体金试纸条上，目标扩增产物的存在会在相应的测试线(T线)上诱导明显的颜色变化。

2.3. 甘蔗花叶病毒mRT-RPA-LFD检测系统的建立

使用RNA等温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型II)进行RPA反应。优化的多重RT-RPA反应体系包含：每个冻干反应管中的29.4μL缓冲液A；SrMV/SCSMV/SCMV的正向和反向引物各2μL(各1μM)，SrMV/SCSMV/SCMV特异性探针各0.6μL(各1μM)；模板和ddH?O总体积为4.3μL，以及2.5μL缓冲液B。混合后，反应混合物在37-42°C的恒温装置中立即孵育15-20分钟。

2.4. mRT-RPA-LFD的优化

通过同时测试SrMV、SCMV和SCSMV的引物、探针和模板的浓度和比例，系统优化了三个引物-探针组的浓度和比例，以实现对SrMV、SCMV和SCSMV片段的可比检测效率。梯度测试使用以下最终浓度的引物/探针进行：120nM引物/36nM探针、40nM引物/12nM探针、20nM引物/6nM探针、120nM引物/12nM探针、40nM引物/6nM探针和20nM引物/3nM探针以确定最佳扩增结果。

2.5. mRT-RPA-LFD检测SrMV、SCSMV和SCMV的灵敏度

甘蔗病毒RNA连续10倍稀释产生7个浓度梯度：1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。使用这些RNA模板进行灵敏度检测，反应按照优化系统配置，包括一个阴性对照(NTC，无模板对照)。通过评估测试条带的清晰度和强度确定mRT-RPA-LFD的检测限(LOD)。

2.6. mRT-RPA-LFD检测SrMV、SCSMV和SCMV的特异性

为了验证mRT-RPA-LFD assay对SrMV、SCMV和SCSMV的特异性，使用来自PVY、SCYLV和SCBV的病毒RNA模板以及TriMV重组质粒DNA(GenBank：FJ263671.1)作为模板在mRT-RPA-LFD分析中进行测试，同时使用阳性( SrMV、SCMV和SCSMV RNA模板的混合物)和阴性(ddH?O)对照。

2.7. mRT-PCR的灵敏度测试

为了验证mRT-RPA-LFD方法在现场检测中的灵敏度和准确性，进行了mRT-PCR测试。设计并合成了用于RT-PCR检测SrMV、SCMV、SCSMV、SCYLV和SCBV的引物。使用2×Rapid Taq Plus Master Mix(Dye Plus)通过两步法进行mRT-PCR：cDNA合成后以10倍稀释的cDNA为模板进行PCR。

2.8. mRT-LAMP的灵敏度测试

为了比较mRT-RPA-LFD和RT-LAMP之间的灵敏度，构建了多重RT-LAMP检测系统。基于SrMV、SCSMV和SCMV的外壳蛋白(CP)编码序列，使用PrimerExplorer V5设计了三组病毒特异性RT-LAMP引物。

2.9. RT-RPA-CRISPR/Cas12a的灵敏度测试

为了比较mRT-RPA-LFD和RT-RPA-CRISPR/Cas12a方法之间的灵敏度，设计并合成了针对SrMV、SCSMV和SCMV的特异性RPA引物和crRNA。将这些病毒的RNA模板连续10倍稀释成7个浓度梯度：1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。

2.10. 用于现场检测SrMV、SCSMV和SCMV的mRT-RPA-LFD平台

为了评估mRT-RPA-LFD平台用于田间样品测试的适用性，从广西大学植物园(中国南宁)收集了20份疑似花叶病毒感染的甘蔗样品。使用基于纤维素试纸条的核酸快速提取方法从叶片样品中提取粗核酸，并用作mRT-RPA-LFD的模板，以评估其在田间诊断中的性能。

研究结果表明，建立的mRT-RPA-LFD检测系统对甘蔗花叶病毒的检测灵敏度达到10fg/μL，比常规mRT-PCR灵敏度高100,000倍，比mRT-LAMP高1000倍。特异性测试显示，该方法对SrMV、SCMV和SCSMV具有高度特异性，与其他甘蔗病毒无交叉反应。现场验证试验表明，该方法能够准确检测田间样品中的单一或混合感染，且整个检测过程可在16分钟内完成，无需复杂设备。

研究的讨论部分强调，甘蔗主要通过甘蔗茎进行无性繁殖，使其极易通过种苗运输传播病毒，加剧各栽培区的病害压力。症状掩盖可能偶尔因温度波动、植株年龄或营养状况而发生。此外，与不同病毒病原体的共同感染导致明显更复杂的症状学，这对灵敏、可现场部署的检测工具形成了迫切需求。

与传统分子诊断相比，RPA对样品杂质具有固有的耐受性，这使得可以用基于纤维素试纸条的方法取代繁琐的核酸提取过程，并将模板制备时间从2小时(使用TRIzol/CTAB) dramatically缩短至仅25秒，且不损害检测灵敏度或准确性，大大节省了时间和成本(低至约0.03元/条)。

与CRISPR/Cas12a技术相比，mRT-RPA-LFD技术显著缩短了检测时间，并消除对专用设备的需求。尽管基于CRISPR/Cas12a的方法在此处和其他病毒检测中表现出可比甚至高10倍的检测灵敏度，但mRT-RPA-LFD技术显著减少了测试时间。

从大规模田间应用的成本角度来看，mRT-RPA-LFD方法的耗材成本约为36.70元/测试，其中包括纤维素试纸条(0.03元/测试)、LFD试纸条(20元/测试)和RPA试剂盒(16.67元/测试)的成本。与常规方法相比：mRT-PCR(包括TRIzol、逆转录和PCR试剂)成本约为27.52元/测试，mRT-LAMP(包括TRIzol、逆转录和LAMP试剂)成本约为48.84元/测试。尽管mRT-RPA-LFD的成本高于mRT-PCR，但低于mRT-LAMP。此外，其优势——不需要专用设备、检测时间快、多重可视化和10fg/μL的高灵敏度(比mRT-PCR高100,000倍，比mRT-LAMP高1000倍)——显著增强了其在大规模现场检测中的实用性，并抵消了耗材成本的差异。

部署和应用无病毒健康种苗仍然是管理甘蔗病毒病的基石策略。将RPA-LFD技术集成到可现场部署的快速检测系统中，能够对种质资源和无病毒种苗进行高通量筛选，解决了当前病害管理工作流程中的一个关键瓶颈。该系统充分发挥了等温扩增和层析检测技术的潜力，有助于早期检测和快速应对甘蔗病毒暴发。此外，其固有的简单性和成本效益使其特别适用于可能缺乏复杂实验室设施的资源有限环境。它在无病毒种苗的工业规模生产和高通量病毒检测方面具有广阔的应用前景，为糖业的可持续健康发展提供有力支持。

总之，研究人员成功开发了一种用于多重甘蔗病毒实验室和田间诊断的mRT-RPA-LFD技术。整个过程不需要复杂的RNA提取和cDNA合成。相反，它在25秒内完成粗核酸提取，随后在37°C下进行10分钟的等温扩增，并在5分钟内在侧向流动试纸条上视觉观察多重靶标，整个过程不超过16分钟。该检测系统以其快速、高效、超灵敏和适合大规模应用的特点，为甘蔗病毒的早期检测和相关病害的有效管理提供了有力支持。该研究成果发表在《Microchemical Journal》期刊上。