综述：甘蔗花叶病毒多重检测技术：mRT-RPA-LFD方法的建立与应用

本综述推荐一种新型甘蔗花叶病毒快速检测技术——多重逆转录重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条（mRT-RPA-LFD）法。该方法通过纤维素试纸30秒核酸提取、37°C恒温10分钟扩增和5分钟可视化判读，实现SrMV、SCSMV和SCMV三种病毒的同时检测，灵敏度达10 fg/μL，为甘蔗病毒田间快速诊断提供高效解决方案。

　　

1. 引言

甘蔗作为全球重要的糖料和能源作物，在生长过程中易受多种病毒侵染，包括高粱花叶病毒（SrMV）、甘蔗花叶病毒（SCMV）、甘蔗条纹花叶病毒（SCSMV）等。这些病毒引起的花叶病导致甘蔗产量和品质严重下降，且常出现混合感染现象，给病毒检测带来巨大挑战。目前病毒防控的关键措施是培育无毒健康种苗，而早期准确检测是病原管理的重要环节。

传统检测方法如RT-PCR、qRT-PCR等虽广泛应用，但存在耗时长、需要专用设备、灵敏度差异大等局限性，难以满足大规模田间应用需求。等温扩增技术因其操作简单、快速高效、无需热变性过程等特点，特别适合现场快速检测。其中重组酶聚合酶扩增（RPA）技术能在22-45°C恒温条件下20分钟内完成DNA扩增，具有灵敏度高、特异性强、兼容多重检测等优势。

2. 材料与方法

2.1. 核酸提取与逆转录

研究采用149份来自广西主要蔗区的甘蔗病毒样品，使用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent提取总RNA，并通过HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。同时建立了基于纤维素试纸的核酸快速提取方法，仅需30秒即可完成核酸提取，包括15秒缓冲液裂解、3秒混合物浸泡、3秒缓冲液洗涤和4秒PCR反应混合物洗脱四个步骤。

2.2. RPA引物和RPA-LFD探针设计

基于GenBank中SrMV、SCSMV和SCMV的完整基因组序列，通过DNAMAN比对保守区域，使用SnapGene 6.0设计病毒特异性RPA检测引物对。所有RPA引物长度30-35 bp，GC含量35%-60%，扩增产物大小180-280 bp。同时设计了46-52 nt长度的病毒特异性杂交探针，5′端分别标记FAM、TAMRA或DIG荧光基团，3′端包含C3 Spacer阻断剂和第31个碱基的dSpacer替代（nfo酶识别位点）。

2.3. mRT-RPA-LFD检测系统的建立

使用RNA等温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型II）进行RPA反应。优化后的多重RT-RPA反应体系（总体积50 μL）包含：29.4 μL缓冲液A，SrMV/SCSMV/SCMV正反向引物各2 μL（1 μM），特异性探针各0.6 μL（1 μM），模板和ddH₂O总体积4.3 μL，以及2.5 μL缓冲液B。反应混合物在37-42°C恒温装置中孵育15-20分钟，产物稀释50-100倍后使用三重靶标核酸检测试纸条进行结果判读。

2.4. mRT-RPA-LFD的条件优化

通过系统优化三种引物-探针组的浓度和比例，实现SrMV、SCMV和SCSMV片段的可比检测效率。测试了120 nM引物/36 nM探针、40 nM引物/12 nM探针等6种浓度组合，最终确定40 nM引物/12 nM探针为最佳浓度。反应时间评估显示10分钟即可获得可接受的效果，37°C被确定为最佳反应温度。

3. 结果

3.1. 甘蔗核酸快速提取效果

纤维素试纸法提取的核酸模板质量良好，条带清晰，与常规TRIzol法和CTAB法提取的模板相比，可直接用于PCR和RPA反应，成功扩增出SrMV（1332 bp）、SCSMV（319 bp）、SCMV（497 bp）等目标病毒的特异性条带。

3.2. mRT-RPA-LFD检测原理

mRT-RPA-LFD技术将多重RT-RPA扩增与胶体金双抗体夹心法相结合，通过将RPA扩增产物滴加到胶体金试纸条上，目标扩增子诱导相应测试线（T线）产生明显的颜色变化。T1、T2、T3线分别固定抗DIG、抗TAMRA和抗FAM单克隆抗体，特异性捕获双标记扩增产物。

3.3. mRT-RPA-LFD的条件优化结果

单重和多重RT-RPA-LFD反应均能产生特异性红色条带。浓度优化实验表明40 nM引物/12 nM探针浓度下条带强度最均匀。温度测试显示37°C时三重试纸条上的T线强度最强且最均匀。时间优化表明10分钟孵育即可获得足够灵敏度。

3.4. mRT-RPA-LFD的灵敏度分析

灵敏度检测显示mRT-RPA-LFD对甘蔗病毒RNA的检测限低至10 fg/μL，比多重RT-PCR灵敏度高10万倍，比多重RT-LAMP高1000倍，与单重RT-RPA-CRISPR/Cas12a方法相当或略低，但大幅缩短了检测时间。

3.5. mRT-RPA-LFD的特异性验证

特异性实验表明，该方法对SrMV、SCSMV和SCMV具有高度特异性，与PVY、SCYLV、SCBV等其他病原体无交叉反应。序列分析显示SCMV、SrMV和SCSMV与其他花叶病毒同源性较低，进一步证实了方法的特异性。

3.6. 现场检测平台的构建

建立了基于mRT-RPA-LFD的田间检测平台，仅需预制备的纤维素试纸、保温杯、预混试剂和移液装置即可完成检测。该平台适应16-40°C环境温度，具有广泛的地理和季节适应性。

3.7. 现场检测验证

对20份疑似感染甘蔗样品进行检测，mRT-RPA-LFD检出6份SrMV阳性、13份SCSMV阳性和1份SCMV阳性样品，结果与单重RT-PCR一致，且比五重RT-PCR具有更高的检出率，显示了其在实地样品检测中的高效性和准确性。

4. 讨论

甘蔗主要通过蔗茎进行无性繁殖，易通过种苗运输传播病毒，加剧各栽培区的病害压力。温度波动、株龄或营养状况变化可能导致症状掩盖，不同病毒病原的共感染导致症状学更加复杂，迫切需要灵敏、可现场部署的检测工具。

本研究开发的多重甘蔗病毒诊断技术mRT-RPA-LFD能够快速、无需设备、同时可视化检测三种主要甘蔗花叶病毒，展示了其在现场甘蔗病毒检测中的明显优势。与传统分子诊断相比，RPA对样品杂质具有固有耐受性，可用纤维素试纸法替代繁琐的核酸提取过程，将模板制备时间从2小时缩短至25秒，且不影响检测灵敏度或准确性。

从大规模田间应用成本角度看，mRT-RPA-LFD方法的耗材成本约为36.70元/测试，虽高于mRT-PCR（27.52元/测试），但低于mRT-LAMP（48.84元/测试）。其不需要专用设备、检测时间短、多重可视化以及10 fg/μL的高灵敏度等优势，显著增强了其在大规模田间检测中的实用性，抵消了耗材成本的差异。

病毒无毒健康种苗的部署和应用仍然是管理甘蔗病毒病的核心策略。将RPA-LFD技术集成到可现场部署的快速检测系统中，能够对种质资源和无毒种苗进行高通量筛选，解决了当前病害管理流程中的关键瓶颈。该系统充分发挥了等温扩增和色谱检测技术的潜力，有助于甘蔗病毒爆发的早期检测和快速响应。

总之，我们成功开发了用于实验室和田间多重甘蔗病毒诊断的mRT-RPA-LFD技术。整个过程无需复杂的RNA提取和cDNA合成，而是在25秒内完成粗核酸提取，随后在37°C恒温扩增10分钟，5分钟内在侧流试纸条上可视化观察多重靶标，全过程不超过16分钟。该检测系统具有快速、高效、超灵敏和适合大规模应用的特点，为甘蔗病毒早期检测和相关病害有效管理提供了有力支持。