基于NIR光谱与高光谱成像的化学计量学及机器学习方法检测锡兰茶中合成染料掺假研究

本研究针对甘蔗花叶病毒田间快速检测难题，开发了基于逆转录重组酶聚合酶扩增（mRT-RPA）结合横向流动试纸条（LFD）的多重可视化检测技术。该技术可在16分钟内同步检测甘蔗花叶病毒（SrMV）、甘蔗条纹花叶病毒（SCSMV）和甘蔗花叶病毒（SCMV），检测灵敏度达10 fg/μL，为甘蔗病毒病防控提供了高效现场筛查方案。

　　

甘蔗作为全球重要的糖料和能源作物，在热带和亚热带地区广泛种植。然而，甘蔗在生长过程中极易受到多种病毒的侵染，包括高粱花叶病毒（SrMV）、甘蔗花叶病毒（SCMV）、甘蔗条纹花叶病毒（SCSMV）、甘蔗黄叶病毒（SCYLV）和甘蔗杆状病毒（SCBV）等。这些病毒，特别是SrMV、SCMV和SCSMV三种花叶病毒，引起的甘蔗花叶病会导致严重的产量和品质损失。更为棘手的是，病毒症状往往只在严重感染的植株上显现，而一些受感染植株因复杂的环境或营养条件可能保持无症状状态，加之甘蔗经常发生多种病毒的混合感染，给病毒检测带来了巨大挑战。

目前，控制甘蔗病毒病的关键措施是培育无病毒健康种苗，而早期准确的病毒检测在病原管理中起着至关重要的作用。虽然已有多种检测方法如RT-PCR、qRT-PCR、多重RT-PCR等被报道，但这些方法存在耗时长、需要专用实验室设备、检测灵敏度不一等缺点，限制了其大规模田间应用。

为了突破这些限制，研究人员将目光投向了等温扩增技术。这类技术能够在恒定温度下快速、高效地扩增核酸，不需要热变性过程，非常适合使用便携式加热设备进行现场检测。其中，重组酶聚合酶扩增（RPA）技术尤为突出，它能在22-45°C的恒定温度下启动指数级DNA扩增，并在20分钟内完成。RPA以其简单、高灵敏度、高特异性、兼容多重检测、极快的扩增速度和恒温操作等优点而著称。

本研究团队成功开发了一种新型的多重甘蔗病毒诊断技术——多重逆转录重组酶聚合酶扩增结合横向流动试纸条（mRT-RPA-LFD）检测方法。该技术能够在单一反应中快速、无需设备、同时可视化检测三种主要甘蔗花叶病毒：高粱花叶病毒（SrMV）、甘蔗花叶病毒（SCMV）和甘蔗条纹花叶病毒（SCSMV），并展示了其在现场甘蔗病毒检测中的显著优势。

研究人员采用纤维素试纸条快速核酸提取方法，将模板制备时间从2小时（使用TRIzol/CTAB）缩短至仅25秒，且不损害检测灵敏度或准确性。他们设计了针对每种病毒的特异性RPA引物和探针，并系统优化了多重RT-RPA反应体系，包括引物/探针浓度、反应温度和孵育时间等关键参数。

在技术方法方面，研究主要基于：1）纤维素试纸条核酸快速提取技术，从甘蔗叶片中快速获取核酸模板；2）多重逆转录重组酶聚合酶扩增（mRT-RPA）技术，在37°C恒温条件下同时扩增多个病毒目标序列；3）横向流动试纸条（LFD）检测，通过免疫层析原理实现检测结果的可视化判读。所有实验使用的149个甘蔗病毒样品来自广西主要蔗区及其他国内甘蔗种植区。

3.1. 甘蔗核酸快速提取效果

研究人员使用预切割的Whatman No. 1纤维素滤纸条，通过四步protocol（15秒裂解、3秒浸泡、3秒洗涤和4秒洗脱）在30秒内完成核酸提取。结果显示，所有使用试纸条方法制备的模板质量良好，条带清晰，与常规TRIzol提取的RNA和CTAB提取的DNA相比，制备的粗模板适用于后续RPA反应。

3.2. mRT-RPA-LFD可视化、免设备同步检测甘蔗花叶病毒的原理

mRT-RPA-LFD的关键优势在于通过将mRT-RPA扩增与基于胶体金的双抗体夹心法相结合，在单一反应中实现快速、多重可视化结果。RPA扩增产物携带不同的报告标签，被试纸条膜上固定的相应抗体捕获，形成三明治复合物，从而实现甘蔗病毒的三重可视化检测。

3.3. 甘蔗花叶病毒mRT-RPA-LFD检测体系的建立

研究人员针对每种病毒设计了特异性RPA引物和探针，建立了多重和单重RT-RPA-LFD检测体系。通过系统优化，确定了40 nM引物/12 nM探针为多重RT-RPA体系的最佳浓度，37°C为最佳反应温度，10分钟为最短有效反应时间。

3.4. mRT-RPA-LFD检测SrMV、SCSMV和SCMV的灵敏度

灵敏度测试显示，mRT-RPA-LFD对混合核酸模板的检测限低至10 fg/μL。与多重RT-PCR（检测限1 ng/μL）和多重RT-LAMP（检测限100 pg/μL）相比，mRT-RPA-LFD的灵敏度分别提高了10万倍和1000倍。与RT-RPA-CRISPR/Cas12a方法相比，虽然Cas12a对SrMV和SCSMV的灵敏度略高（1 fg/μL），但mRT-RPA-LFD显著缩短了检测时间，消除了对专业设备的需求。

3.5. mRT-RPA-LFD检测SrMV、SCSMV和SCMV的特异性

特异性验证表明，mRT-RPA-LFD对非目标模板（PVY、SCYLV、SCBV和TriMV）和阴性对照均无交叉反应，仅在对目标模板（SrMV、SCSMV和SCMV）检测时显示正常显色。序列一致性分析和引物/探针结合活性测定进一步证实了该方法与其他非主要甘蔗花叶病毒无交叉反应。

3.6. 用于现场检测SrMV、SCSMV和SCMV的mRT-RPA-LFD平台构建

研究人员构建了一个mRT-RPA-LFD现场测试平台，仅需简单工具：预制备的纤维素试纸条、保温杯、预混合试剂和移液设备。该平台消除了传统核酸提取过程和热循环仪的需求，显著降低了检测复杂性和成本，非常适合甘蔗病毒的快速现场检测。环境温度适应性测试表明，该检测平台能够适应不同的环境温度，表现出广泛的地理和季节适应性。

3.7. mRT-RPA-LFD平台快速、可视化、同步现场检测SrMV、SCSMV和SCMV的验证

对20个田间样品的检测验证显示，mRT-RPA-LFD检测结果与单重RT-PCR结果一致，但比五重RT-PCR具有更高的检测率。在SCSMV检测中，mRT-RPA-LFD能够清晰检测到琼脂糖凝胶电泳中条带极弱的样品，避免了假阴性检测，突显了其在可视化扩增产物方面的显著优势。

研究结论表明，mRT-RPA-LFD技术为甘蔗花叶病毒的现场快速检测提供了一种高效、准确的解决方案。整个检测过程无需复杂的RNA提取和cDNA合成，可在16分钟内完成粗核酸提取、等温扩增和可视化检测，具有快速、高效、超灵敏和适合大规模应用的特点。

讨论部分强调，甘蔗主要通过甘蔗茎进行无性繁殖，使其极易通过种苗运输传播病毒，加剧各栽培区的病害压力。症状掩盖可能因温度波动、植株年龄或营养状况而偶尔发生，加之不同病毒病原体的共感染导致症状学显著更加复杂，这对敏感、可现场部署的检测工具形成了迫切需求。

与常规分子诊断相比，RPA对样品杂质具有固有的耐受性，使其能够用纤维素试纸条based方法替代繁琐的核酸提取过程，将模板制备时间从2小时 dramatically缩短至仅25秒。虽然mRT-RPA-LFD的消耗品成本（约36.70元/测试）高于mRT-PCR（约27.52元/测试），但其优势——不需要专用设备、检测时间短、多重可视化和10 fg/μL的高灵敏度（比mRT-PCR高10万倍，比mRT-LAMP高1000倍）——显著增强了其在大规模现场检测中的实用性，抵消了消耗品成本的差异。

无病毒健康种苗的部署和应用仍然是管理甘蔗病毒病的基石策略。将RPA-LFD技术集成到可现场部署的快速检测系统中，实现了对种质资源和无病毒种苗的高通量筛选，解决了当前病害管理 workflow中的关键瓶颈。该系统充分利用了等温扩增和色谱检测技术的潜力，促进了甘蔗病毒爆发的早期检测和快速响应。

该研究发表在《Microchemical Journal》上，为甘蔗病毒病的早期检测和相关病害的有效管理提供了强有力的技术支持，对糖业的可持续健康发展具有重要意义。