白腐与褐腐伞型孢菌CAZy酶比较转录组学：木质纤维素降解的进化新见与GH16糖苷水解酶功能分化的意义

本研究通过比较白腐菌(WRF)和褐腐菌(BRF)在杨木与葡萄糖培养基中的转录组差异，系统揭示了二者在木质纤维素降解中的CAZy酶谱特征。研究发现GH16糖苷水解酶是唯一在所有物种中均上调的CAZy家族，其功能分化反映了真菌降解策略的进化适应性，为生物质转化技术提供了新靶点。

　　

在我们这个追求可持续发展的时代，如何高效利用地球上最丰富的可再生资源——植物木质纤维素生物质，成为了一个关键的科学问题。每年自然界产生超过1800亿吨的木质纤维素，如果能将其转化为生物燃料或高附加值生物产品，将大大减少对化石资源的依赖。然而，木质纤维素结构复杂，其降解需要专门的微生物酶系统。其中，担子菌门真菌，特别是白腐菌和褐腐菌，是自然界中最重要的木质纤维素分解者，它们通过不同的机制降解木材。白腐菌能同时分解木质素和多糖，留下白色纤维残渣；而褐腐菌则丢失了大部分木质素降解过氧化物酶，转而依赖活性氧物种和简化的酶组来快速修饰木质素并解聚碳水化合物。尽管过去几十年对真菌降解木质纤维素的研究取得了显著进展，但不同真菌类群在面对复杂木质纤维素底物时，其转录组响应和酶系统调控策略的异同，尤其是是否存在共同的核心降解机制，仍然是科学家们积极探索的前沿问题。

为了深入探究这一问题，由Idoia Jiménez、Manuel Alfaro等来自西班牙纳瓦拉公立大学应用生物学多学科研究所（IMAB）的研究团队，以及美国联合基因组研究所（JGI）的科学家合作，在《New Biotechnology》上发表了他们的最新研究成果。他们选取了三种白腐菌（平菇Pleurotus ostreatus、黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium和不规则异担子菌Heterobasidion irregulare）和两种褐腐菌（Fomitopsis schrenkii和Rhodonia placenta），通过比较转录组学方法，系统分析了这些真菌在以杨木和葡萄糖作为唯一碳源的培养基中的基因表达差异，特别关注了碳水化合物活性酶（CAZymes）的表达模式，旨在揭示白腐和褐腐真菌在木质纤维素降解中的保守和分化策略。

本研究主要运用了以下几项关键技术方法：研究人员将五种真菌菌株在补充有葡萄糖或杨木屑的Highley培养基中进行培养，培养10天后收获菌丝体。使用Illumina HiSeq 2000平台进行RNA测序（RNA-seq）。对获得的FASTQ文件进行质量控制（FastQC）、接头修剪（Cutadapt）后，利用STAR软件将高质量 reads 比对到各真菌的参考基因组上。基因水平定量使用FeatureCounts，差异表达分析则利用limma软件包（配合voom转换）进行，以TPM（每百万转录本）值评估基因表达水平。功能注释通过eggNOG-mapper和JGI MycoCosm数据库完成，并对KOG（真核生物直系同源群）类别进行了富集分析。针对关键的GH16家族，研究人员进行了多序列比对（CLUSTAL）、系统发育树构建（IQ-TREE）和三维结构预测（AlphaFold2），以探究其序列和结构特征。

3.1. 比较转录组学

通过分析五个真菌物种在葡萄糖（G）和木材（W）培养基中的转录组，研究发现不同物种对碳源的转录响应存在显著差异。总体而言，在木材条件下上调的基因数量（3560个）多于葡萄糖条件（2295个）。黄孢原毛平革菌（Ph. chrysosporium）在木材中表现出最高比例的上调基因（10.13%），显示出广泛的转录重编程，而其他物种如平菇（P. ostreatus）和不规则异担子菌（H. irregulare）的反应则相对保守。基因表达倍数变化（logFC）的分布也揭示了物种特异性的转录可塑性，白腐菌通常比褐腐菌表现出更广泛的表达变化。

3.2. 利用KOG类别对表达基因进行比较功能分析

KOG（真核生物直系同源群）功能分类显示，在木材条件下，与碳水化合物转运和代谢（G类）、次级代谢物生物合成（Q类）以及能量产生与转换（C类）相关的基因显著富集。这表明生长在木材上需要激活复杂的碳水化合物降解和能量代谢途径。相比之下，葡萄糖条件下的富集模式更分散且信号较弱。在所有物种中，代谢功能相关的上调基因占比最大（W: 45.80%， G: 45.03%），其中碳水化合物代谢（G类）在木材条件下从葡萄糖的8.83%大幅提升至17.80%，凸显了真菌在分解木材时对CAZyme活性的高度依赖。

3.3. CAZy酶转录组谱揭示真菌生物质分解中的物种特异性策略

RNA-seq分析鉴定出153个CAZy家族在至少一个物种中有差异表达。维恩图分析表明，在木材条件下，不同真菌物种间共享和特有的上调CAZy家族存在明显差异。三个白腐菌共享28个上调的CAZy家族，包括AA3、AA9、GH3、GH6、GH7和CBM1等，反映了其广泛的木质纤维素降解能力。两个褐腐菌仅共享三个上调家族：GH2、GH16和Expansins（EXPN，非CAZy酶但参与细胞壁降解），显示出更精简的酶策略。值得注意的是，GH16是唯一一个在所有五个物种的木材条件下均一致上调的CAZy家族，表明其在真菌木材降解或适应中可能具有核心且保守的作用。

3.4. 累积基因表达模式和CAZy酶的转录投入

通过计算累积TPM来评估转录投入，发现CAZy基因，包括上调的CAZy基因，在转录本丰度排名中分布广泛。一些基因贡献了显著的转录投入，而另一些则表达水平较低。特别关注的GH16基因在不同物种中的转录排名差异很大，例如H. irregulare的基因ID: 61600和F. schrenkii的基因ID: 98853排名非常靠前（分别为第98和54位），表明它们可能是这些物种中非常重要的基因。

3.5. GH16在WR和BR中的表达和结构变异性比较分析

对GH16家族酶的深入分析显示，尽管所有物种都拥有20-27个GH16基因拷贝，但在木材条件下每个物种仅有1-3个拷贝被显著上调。主成分分析（PCA）表明，白腐菌和褐腐菌的GH16序列存在一定的分离，白腐菌序列变异性更大，而褐腐菌序列更保守。系统发育树分析将上调的GH16酶归类到不同的功能分支中，如内切β-1,3-葡聚糖酶、木葡聚糖内切转葡糖苷酶/水解酶和昆布多糖酶等。三维结构预测（AlphaFold2）揭示了这些GH16酶在结构上的多样性，例如信号肽和跨膜域的存在与否不同，这暗示了它们可能具有不同的亚细胞定位和功能。部分上调的GH16酶（如P. ostreatus的Po_84195、F. schrenkii的Fs_98853等）的催化活性位点 motif（EXDX(X)E）发生了变异，可能影响其功能。

研究的讨论部分强调，转录组分析揭示了白腐菌和褐腐菌在木材降解策略上存在根本差异。白腐菌表现出广泛的转录重编程和丰富的CAZyme上调，与其全面的木质纤维素降解能力一致。褐腐菌，尤其是R. placenta，则表现出更有限的转录变化，依赖于组成型表达和非酶促氧化机制。GH16家族在所有物种中的保守上调是一个关键发现，但其确切功能仍待阐明，可能涉及植物半纤维素降解、真菌细胞壁重塑或两者兼有。序列和结构上的变异表明GH16家族内部存在功能分化，以适应不同的生态位和底物。

综上所述，这项研究通过比较转录组学深入揭示了白腐菌和褐腐菌在木质纤维素降解中的分子适应策略。研究不仅确认了二者在CAZyme使用上的显著差异，还发现GH16糖苷水解酶是一个在两类真菌中共同响应木材诱导的关键家族。这些发现增进了我们对真菌木质纤维素降解机制进化的理解，为开发更高效的生物质转化酶制剂提供了新的候选靶点，对真菌生态学、进化生物学以及生物技术应用（如生物能源和生物炼制）具有重要意义。未来的研究需要结合蛋白质组学、生化分析和基因操作等功能验证实验，来精确阐明GH16等关键酶的具体功能及其在木质纤维素降解网络中的作用。