流感病毒NS1蛋白通过m6A修饰介导病毒mRNA剪接自调控的新机制

本研究揭示了甲型流感病毒NS1蛋白通过N6-甲基腺苷（m6A）修饰自调控其mRNA剪接的表观遗传新机制。研究发现NS1通过动态调控m6A甲基化水平，招募阅读蛋白YTHDC1竞争性抑制剪接因子SRSF3结合，进而精细调控病毒复制效率。该保守的A385位点为广谱抗病毒药物研发提供了新靶点。

　　

流感病毒NS1通过m⁶A修饰调控自身mRNA剪接的机制研究

Abstract

甲型流感病毒复制需要未剪接和剪接病毒mRNA之间的精确平衡。本研究揭示了一种表观遗传策略：病毒NS1蛋白通过N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰自调控其mRNA剪接。具体而言，NS mRNA上A385位点的m⁶A修饰招募m⁶A阅读蛋白YTHDC1，竞争性抑制剪接因子SRSF3结合邻近位点。重要的是，A385 m⁶A位点在人和禽流感毒株的NS片段中保守且对剪接调控至关重要。研究结果表明，NS1通过动态调控m⁶A水平来精细调节病毒mRNA加工以增强复制效率。

Introduction

RNA转录后修饰在生物体中具有重要功能，其中N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是最丰富的修饰类型。m⁶A修饰涉及甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和阅读蛋白（readers）等蛋白复合物。研究表明m⁶A修饰在病毒生命周期中发挥重要作用，但其在流感病毒中的具体调控机制尚不清楚。

甲型流感病毒NS1蛋白在病毒生命周期中发挥多重功能，但其在自身mRNA剪接调控中的作用存在争议。早期研究使用转染系统得出矛盾结论，而本研究通过构建新型突变病毒，在感染条件下系统研究NS1的调控功能。

Materials and Methods

本研究使用人胚胎肾293T细胞、人肺癌A549细胞、非洲绿猴肾上皮细胞（Vero）和鸡胚成纤维细胞（DF-1）等细胞系。通过反向遗传学技术构建WSN/Ans1突变病毒（在NS片段开放阅读框中引入两个终止密码子），该病毒可转录NS mRNA但不能翻译功能性NS1蛋白。

实验方法包括免疫共沉淀、Western blot、RNA荧光原位杂交、实时定量PCR、RNA免疫沉淀qPCR、纳米孔直接RNA测序等技术。使用特异性抗体检测病毒蛋白和m⁶A相关蛋白的表达和相互作用。

Results

NS1负调控NS mRNA剪接

通过构建WSN/Ans1突变病毒，研究发现缺乏NS1蛋白显著抑制病毒在Vero细胞中的复制，在A549细胞中完全不能形成噬斑。感染实验显示，NS1缺失导致NEP/NS1比率增加，表明剪接效率提高。外源性NEP蛋白补充实验证实剪接改变与NEP缺乏无关，证明NS1自身负调控其mRNA剪接。

NS1增强NS mRNA的m⁶A修饰

RNA pull-down和质谱分析发现m⁶A阅读蛋白YTHDC1与NS mRNA相互作用。YTHDC1敲除细胞中病毒复制减弱。m⁶A免疫沉淀实验证实NS mRNA存在m⁶A修饰，且NS1缺失显著影响修饰水平。

研究发现NS1通过负反馈机制调控m⁶A添加：低浓度NS1促进m⁶A修饰，高浓度则抑制修饰水平。免疫共沉淀显示NS1与甲基转移酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5相互作用，其中METTL3结合随NS1浓度增加而显著减少，是主要调控机制。

NS片段A385位点的m⁶A修饰

通过改良的MeRIP-RT-qPCR和纳米孔直接RNA测序技术，精确定位A385为NS mRNA上的m⁶A修饰位点。构建A385C突变病毒证实该位点对m⁶A修饰和剪接调控至关重要。突变病毒复制能力减弱，剪接效率提高。

m⁶A介导剪接调控的进化保守性

分析79,404条人源和禽源流感病毒序列，发现A385位点高度保守。在不同亚型毒株（H1N1、H3N2、H5N1、H9N2）中验证了m⁶A修饰的存在和功能保守性。A385C突变在所有毒株中均降低m⁶A水平并提高剪接比率，但在禽源毒株哺乳动物细胞感染中调控作用较弱，提示物种特异性调控。

YTHDC1与SRSF3竞争性结合调控剪接

YTHDC1敲除增加NS mRNA剪接比率，而SRSF3敲低降低剪接比率，表明二者在剪接调控中作用相反。RNA免疫沉淀实验显示，YTHDC1缺失或m⁶A修饰缺失增强SRSF3与NS mRNA结合，YTHDC1过表达则剂量依赖性抑制SRSF3结合。

通过精细定位发现SRSF3结合位点位于A385邻近的396-419bp区域。YTHDC1通过m⁶A修饰招募后，空间位阻抑制SRSF3结合其靶位点，从而抑制剪接。

Discussion

本研究揭示了NS1通过m⁶A修饰自调控其mRNA剪接的新机制。NS1通过动态调控m⁶A水平维持NS1/NEP表达平衡，这对病毒复制至关重要。保守的A385位点功能为广谱抗病毒策略提供新靶点。

研究发现m⁶A修饰在禽源和哺乳动物源毒株中均调控剪接，但存在物种特异性差异，反映了病毒与宿主m⁶A系统的共进化。靶向该保守位点的治疗策略可能具有广谱性和高遗传屏障。

需要注意的是，本研究在癌细胞系中进行，未来需要在原代细胞和动物模型中验证机制。总之，该研究阐明了m⁶A修饰在流感病毒mRNA加工中的关键作用，为抗病毒治疗提供新思路。

Author contributions

Y.L.和B.W-Y.M.负责课题设计，Y.L.、B.W-Y.M.、P.W.和J.L.进行实验操作和数据分析，Y.L.和B.W-Y.M.撰写初稿，所有作者参与文稿修改。

Acknowledgements

研究获得香港特别行政区政府创新科技署、健康@InnoHK和研究资助局主题研究计划资助。感谢Jane Rayner博士协助文稿编辑，武汉贝纳基因科技有限公司完成纳米孔直接RNA测序。