综述：希望与障碍：解锁非洲猪瘟减毒活病毒疫苗的潜力

本综述系统探讨了非洲猪瘟减毒活病毒（MLV）疫苗的最新进展，聚焦基因缺失策略对疫苗保护效力与安全性的影响，全面梳理了当前已知的单基因及多基因缺失靶点（如MGF360/505、I177L、EP402R等），并分析了其面临的技术、安全性与监管挑战，为下一代ASF疫苗的理性设计提供了重要参考。

　　

经典MLV：天然减毒与细胞传代减毒的ASF MLV

若干天然减毒的ASFV毒株（如基因I型NH/P68、OUR T88/3和基因II型Lv/17/WB/Rie1）在攻毒实验中显示出不同程度的同源或异源保护力。例如，NH/P68对基因I型L60毒株提供完全保护，但对基因II型ARM/07仅提供部分保护；而Lv/17/WB/Rie1虽能完全抵抗同源强毒攻击，但免疫猪仍可出现轻度临床症状和间歇性低水平病毒血症。值得注意的是，鼻内接种OUR T88/3可显著减轻临床症状，并将对OUR T88/1的保护率从肌注的50–66%提升至100%。然而，这类天然减毒株常伴随慢性感染、发热及关节肿胀等安全性问题，凸显了其应用局限性。

通过细胞连续传代（如Vero、COS7或原代肺泡巨噬细胞）也可获得减毒株，但往往以免疫原性下降为代价。例如，ASFV-G（基因II型）经110代Vero细胞传代后完全丧失毒力，但也失去保护能力，可能与末端基因组区域的大片段缺失有关。近年来的研究有所突破：例如在CA-CAS-01-A细胞上传代获得的ASFV-MEC-01株能有效抵抗亲本毒株Korea/Wild boar/Hwacheon/2020的攻击。总体而言，传统减毒策略虽有一定潜力，但其不可预测性和安全性隐患促使研究者转向更精准的基因工程减毒途径。

基因工程MLV：基因缺失的ASF MLV

利用分子生物学技术靶向删除与病毒复制、毒力或免疫调节相关的基因，可更可控地获得减毒株且通常保留免疫原性。随着基因功能研究的深入和基因编辑技术的进步，该策略已成为ASF MLV开发的主流方向。

多基因家族（MGF）缺失的MLV

ASFV编码的五类多基因家族（MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505）在调节毒力、宿主范围及抑制宿主免疫应答中起关键作用。自然弱毒株或细胞传代株通常含有较少的MGF基因，暗示其与毒力衰减相关。单一MGF基因缺失（如MGF100-1R、MGF110-5L、MGF360-14L等）在强毒株中往往不能有效减毒，而双基因或多基因缺失则表现更优。例如，缺失MGF505-7R（I型干扰素拮抗剂）可产生剂量依赖性减毒：低剂量接种时猪存活率达100%，但高剂量仍致43%死亡率。若进一步联合缺失MGF360-9L或MGF110-9L，则可显著增强减毒效果。

HLJ/18-6GD（缺失MGF505-1R、-2R、-3R和MGF360-12L、-13L、-14L）完全减毒并提供完全保护，但猪体内连续传代后可能出现毒力回复。类似地，ASFV-G-ΔMGF（缺失相同六基因）虽能诱导强保护免疫，但在第三代传代后出现基因组突变和轻中度临床症状。其他策略如删除SY18株的L7L-L11L（含MGF100成员）在保持巨噬细胞内高效复制的同时实现了完全保护。总体而言，靶向多个MGF基因的缺失策略在安全性与效力间更具潜力，但遗传稳定性问题仍需通过附加缺失其他毒力基因来解决。

血吸附相关基因缺失的MLV

血吸附现象由CD2v蛋白（EP402R编码）介导，其缺失在不同毒株中效果各异：在基因II型Malawi Lil-20/1、ASFV-G和HLJ/18中缺失CD2v未明显减毒；而在基因IX型Kenya 1033中导致部分减毒（仅 transient发热和食欲减退）；在基因I型BA71株中则完全减毒且能抵抗同源及异源（E75、Georgia 2007/1）攻毒。近期研究在缺失株GeorgiaΔK145RΔEP153R（GΔKE）和GeorgiaΔDP148RΔK145RΔEP153R（GΔDKE）中引入CD2v点突变（Q96R、K108D），成功消除血吸附并降低病毒血症，保护率达83–100%。但交叉保护评估显示，其对基因I型Benin 97/1保护率仅57–71%，对基因IX型Kenya 1033则无保护。

EP153R被认为可稳定CD2v与猪红细胞配体的结合。其单独缺失（如NH/P68ΔEP153R）不影响毒力但提供完全保护，而EP402R与EP153R双缺失（BA71ΔCD2EP153R）反而使效力降至60%。这表明多功能基因的联合缺失未必能协同增效，且效果具有毒株依赖性。

其他关键病毒基因缺失的MLV

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  I177L：高度保守的晚期复制蛋白。其缺失株ASFV-G-ΔI177L复制能力下降100–1000倍，经肌注（10² HAD₅₀）或鼻内（10⁶ HAD₅₀）免疫均可提供完全保护，无组织病毒DNA检出且无残留毒力。该株于2022年在越南获批上市，但田间应用中出现部分猪死亡，提示潜在潜伏感染或免疫程序问题。
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  NL（DP71L）、UK（DP96R）与9GL（B119L）：9GL缺失在多个基因型（II、XX）中均能减毒并诱导保护，而NL或UK缺失仅在特定毒株（如基因I型E70）中有效。ASFV-G-Δ9GLΔUK双缺失实现完全减毒和保护，但追加NL缺失会导致复制缺陷与保护失败。
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  复制相关基因（如A104R、K196R、QP383R、QP509L）：多数单一缺失要么过度减毒（如A104R缺失后无保护），要么减毒不足（如C962R、E165R缺失无影响），限制其应用价值。
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  免疫逃避相关基因（如A137R、A238L、A224L）：A137R缺失株完全减毒但导致持续感染；A151R、E184L或H240R缺失保留残留毒力；A224L或A238L缺失仅提供同源保护。其他基因（如B125R、E66L）缺失则基本无效。

多毒力基因缺失的MLV

为平衡安全性与效力，多基因缺失策略日益受青睐。常见组合包括：

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  EP402R与其他毒力基因共缺失（如SY18-ΔCD2v-ΔUK、GZ201801-ΔECM3），实现完全减毒与保护。
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  免疫调节与毒力基因协同缺失（如HLJ/18-7GD在六基因缺失基础上追加EP402R缺失，显著提升安全性且稳定传代）。
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  功能互补基因组合缺失。

然而，ASFV的快速进化（如基因I/II重组株的出现）挑战了现有基因II型MLV的交叉保护能力，凸显广谱疫苗的迫切需求。

ASF MLV疫苗的生产细胞系

原代肺泡巨噬细胞是ASFV培养的金标准，但成本高、批间差大，阻碍大规模生产。永生化猪巨噬细胞系（如ZMAC-4、IPKM）和野猪肺细胞（WSL）可支持病毒复制。非猪源细胞（如Vero、COS-1）虽可用，但病毒适应常伴随基因组变异与保护力丧失（如ASFV-VP110代完全减毒但无保护）。近期进展包括BK2258（野猪胎肾细胞）和PIPEC（Plum Island猪上皮细胞）系，后者培养的ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR在保持免疫原性的同时获得基因组缺失。这些平台也为复制缺陷型单周期疫苗（需辅助细胞系表达必需蛋白）奠定基础，虽尚未实现，却是未来方向。

ASF MLV疫苗的要求

WOAH于2025年修订的框架明确了ASF MLV的生产与测试标准：

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  主种子病毒（MSV）需详述生物学特性、无菌性、纯度、外源因子缺失及适用性，优选ZMAC-4、PIPEC或IPKM等细胞培养，传代不超过5代。
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  终产品需验证无菌、身份、纯度、安全性、批次效价及残留水分。
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  审批重点包括安全性（孕猪与仔猪试验、传播风险、组织病毒复制）和效力（至少5代猪传代毒力回复试验）。

该框架为ASF MLV的评估、生产与批准提供了全面指导。

结语

ASFV仍是全球养猪业最严峻的疫病威胁。尽管基因II型MLV疫苗获批标志着重要进展，但基因I/II重组株的出现暴露了交叉保护的不足。未来MLV设计需综合选择病毒骨架、保守靶点及多毒力基因组合缺失，并依托流行病学监测与田间评估。本综述汇总的所有基因靶点中，三大类最具潜力：免疫逃避相关（如MGF成员）、保守毒力决定簇（如I177L）及病原性调节因子（如EP402R）。整合WOAH指南与当前设计重点，我们勾勒了ASF MLV疫苗的开发路径（图5），为安全、有效、广谱疫苗的诞生铺路。