乳腺癌病理中脂肪细胞形态学图谱：风险因素与肿瘤微环境的相互作用

本综述系统总结了不同乳腺病理状态下脂肪细胞的形态特征，重点探讨了更年期状态、体重指数（BMI）和乳腺密度（MD）等风险因素如何影响癌症相关脂肪细胞（CAAs）的形态。研究通过数字化病理分析揭示，CAAs较远处脂肪细胞更小、更不规则，且其形态受风险因素调控，较小的CAAs与较差生存率相关。这些发现为理解脂肪细胞在乳腺癌发生中的作用提供了新的形态学视角和机制见解。

　　

引言

脂肪组织是乳腺的主要细胞成分，具有重要的内分泌功能。它由脂肪细胞和富含胶原的细胞外基质组成，其中嵌入巨噬细胞、前脂肪细胞和成纤维细胞等其他细胞类型。白色脂肪细胞是乳腺脂肪组织中最常见的类型。这些高度特化的细胞以甘油三酯的形式储存能量，可以分解为甘油和脂肪酸以满足局部或全身能量需求。在乳腺癌中，靠近肿瘤前沿的脂肪细胞被称为癌症相关脂肪细胞（CAAs）。乳腺癌细胞可诱导脂肪细胞脂解，导致CAAs因脂质储存减少而变得更小、更细长且形状不规则。先前的研究强调了CAAs和远处脂肪细胞在面积和/或直径上的差异。研究发现，脂肪细胞大小在不同类型的乳腺癌之间存在差异。浸润性小叶癌患者的CAAs和远处脂肪细胞比浸润性导管癌（IDC）患者的更小，并且原发性导管原位癌中远处脂肪细胞大小与发生同侧IDC的风险呈正相关。

乳腺癌风险因素，包括更年期状态、肥胖和乳腺密度（MD），可以影响乳腺脂肪组织。然而，这三种风险因素之间的关系是复杂的。MD和BMI在乳腺癌风险方面呈负相关。随着MD增加，乳腺中脂肪组织的比例减少，而BMI增加则与脂肪组织增加相关。尽管脂肪组织体积存在差异，但这两种因素都会增加乳腺癌发生的风险。高MD（定义为>75%的纤维腺体组织）使女性风险比低MD（主要是脂肪组织，<25%纤维腺体组织）增加1至6倍。此外，研究发现肥胖绝经后女性比肥胖绝经前女性患乳腺癌的风险更高。绝经后，脂肪组织成为雌激素的主要来源，因为卵巢停止生产。体重增加会加剧这种情况，因为乳腺内脂肪组织的积累可以增加芳香化酶的表达。这种酶催化雄激素转化为雌激素，并将局部可用雌激素水平提高到系统水平的10倍。这些局部激素水平的变化已被报道影响脂肪细胞形态，绝经后女性脂肪细胞直径与芳香化酶表达的正相关性比绝经前女性更强。

目前尚不完全了解更年期状态、BMI，尤其是MD是否影响乳腺癌发展过程中CAAs典型的尺寸减小和球形度降低的形状。因此，本研究利用数字化病理学来表征与这三种乳腺癌风险因素相关的脂肪细胞形态差异。通过纳入癌症和正常样本，该研究还检验了这些风险因素如何在不受癌症影响和受癌症影响的情况下影响脂肪细胞大小，从而深入了解这些风险因素是否影响改变的脂肪细胞形态对乳腺癌风险、发展和进程的贡献。

结果

癌症相关脂肪细胞在形态上不同于邻近的正常脂肪细胞

在正常和乳腺癌组织样本中评估了脂肪细胞形态。与远处脂肪细胞相比，CAAs的尺寸减小了28.7%。在正常样本中靠近乳腺上皮细胞的脂肪细胞也观察到类似的尺寸减小趋势（13.9%）。与组织病理学无关，邻近脂肪细胞还具有更低的凹度和更高的纵横比，意味着它们比远处脂肪细胞更细长。与正常样本的邻近脂肪细胞相比，CAAs更小、凹度更低、更细长。随机森林模型中讨论的其他参数进一步支持了这些发现，因为与正常邻近脂肪细胞相比，CAAs具有更小的凸面面积、费雷特直径和宽度。总的来说，这些发现表明，脂肪细胞的形态根据其在乳腺内的位置以及组织病理学而发生了改变。

脂肪细胞大小根据更年期状态而异

将样本分为绝经前和绝经后组，以评估更年期状态对脂肪细胞形态的潜在影响。在乳腺癌组织中，无论更年期状态如何，邻近脂肪细胞都比远处脂肪细胞更小、凹度更低。这种趋势在正常样本中也观察到。乳腺癌样本中更年期组之间的尺寸比较显示，绝经前样本的CAAs小于绝经后样本的CAAs和远处脂肪细胞。在正常样本的更年期组之间未见差异。纵横比差异有限，除了在乳腺癌样本中，绝经后远处脂肪细胞比绝经前和绝经后样本的邻近脂肪细胞更不细长。在正常样本中，仅在绝经前样本中，远处脂肪细胞比邻近脂肪细胞更不细长。这些结果表明，癌症脂肪细胞形态不仅受其在乳腺内的位置和组织病理学的影响，还受更年期状态的影响，绝经前组的CAAs比绝经后组更小。

脂肪细胞大小与BMI呈正相关

将50例癌症和84例正常样本按BMI四分位数分层。对于癌症病例，邻近和远处脂肪细胞的大小从低BMI组到高BMI组增加。在正常邻近脂肪细胞大小从第2组到第4组也观察到类似趋势。正常远处脂肪细胞从最高BMI组大于第2组和第3组。关于形状，CAA凹度差异很小，但远处癌症脂肪细胞凹度与BMI呈正相关，直到第3组。这种凹度随BMI增加的趋势在正常脂肪细胞从第2组到第4组也可见。纵横比未见差异，除了在乳腺癌样本中，最低BMI的邻近脂肪细胞比最高BMI的邻近脂肪细胞更圆。该分析表明，脂肪细胞大小而非形状可能随BMI改变更多，并且随着BMI增加而尺寸增大在癌症样本的脂肪细胞中比正常样本更明显。

在致密乳腺中，远处癌症脂肪细胞更小且更细长

进一步评估癌症和正常样本，以确定MD是否与改变的脂肪细胞形态相关。根据BI-RAD系统将样本分为四个MD组。在癌症样本中，尺寸差异仅见于远处脂肪细胞，其随着密度增加而变小。在正常样本中也观察到这种趋势，但仅见于邻近脂肪细胞。正常样本中的远处脂肪细胞没有总体尺寸趋势，仅第2组的脂肪细胞大于第3组和第4组。CAA或正常远处脂肪细胞形状未见差异。在癌症样本中，来自最不致密乳腺的远处脂肪比比第2组和第4组的脂肪细胞更凹。此外，来自最致密乳腺的远处脂肪比比最不致密乳腺的脂肪细胞更细长。在正常样本中，来自最致密乳腺的邻近脂肪比比低密度组的脂肪细胞凹度更低。第3组的脂肪细胞比其他组更细长。这些结果表明，MD的变化可能与癌症样本中远处脂肪细胞形态和正常样本中邻近脂肪细胞形态的差异有关。

来自后来患乳腺癌的供体的正常脂肪细胞更大

分析了正常、易感、乳腺癌和对侧样本，以确定正常邻近脂肪细胞的形态是否因临床病史而异。从后来发展为乳腺癌的女性获得的正常组织中的脂肪细胞（称为易感）比从未有乳腺癌病史或诊断的女性获得的正常组织中的脂肪细胞更大。然而，这两组脂肪细胞的形状没有差异。有趣的是，正常和对侧脂肪细胞的大小没有差异，并且是四组中最圆的。这些发现表明，正常邻近脂肪细胞在形态上与对侧脂肪细胞相似，并且与易感和肿瘤脂肪细胞不同。

脂肪细胞形态不影响患者生存

已知68例癌症病例的临床结局。根据中位值将邻近脂肪细胞分为两组。较小的CAAs与比较大的脂肪细胞更差的生存结局相关。然而，CAAs的形状以及远处脂肪细胞的大小和形状未见显著差异。这些结果表明CAA大小可能在患者生存中发挥作用，因此进一步研究可以为了解脂肪细胞形态分析是否具有临床应用提供更多见解。

脂肪细胞形态在分为三阴性和雌激素受体阳性乳腺癌亚型时存在差异

评估了脂肪细胞形态与各种病理特征的关系，包括肿瘤大小、分级和癌症亚型。肿瘤大小和分级不影响脂肪细胞形态，无论其与癌细胞的接近程度如何。然而，当按癌症亚型分层时，三阴性乳腺癌样本的脂肪细胞比雌激素受体阳性乳腺癌样本的脂肪细胞更小、凹度更低、更细长。该分析表明肿瘤大小和分级可能不影响脂肪细胞形态，但乳腺癌亚型确实有影响。

讨论

虽然在定义肿瘤微环境细胞如何与癌细胞通讯方面取得了很大进展，但直到最近才考虑到脂肪细胞。以前通过手动测量组织切片中的脂肪细胞直径来评估脂肪细胞在乳腺癌中的作用。然而，脂肪细胞的大小、形状和轮廓在组织切片中可能高度不规则，因此开发了替代的自动化方法。

我们观察到，靠近肿瘤前沿的脂肪细胞比远处脂肪细胞更小，形状更像成纤维细胞。其他研究也报道了这一点，随后邻近脂肪细胞被确认为CAAs。有趣的是，乳腺癌样本中邻近和远处脂肪细胞之间的这种关系在正常样本中当我们根据其与乳腺上皮细胞的接近程度评估脂肪细胞时也可见。这可以被认为是无癌细胞影响下邻近和远处脂肪细胞之间的基线差异。邻近脂肪细胞尺寸的减小可能是细胞外基质中胶原硬度的结果。这表明，如果未考虑此基线，则癌症对CAAs的影响可能在先前的研究中被高估，强调了研究正常样本的重要性。然而，癌症样本中的尺寸减小幅度增加了一倍多。鉴于肿瘤大小与脂肪细胞形态之间没有相关性，这种进一步的减小可能不是由肿瘤压迫脂肪细胞引起的。相反，这可能是癌细胞和脂肪细胞之间潜在双向串扰的结果。乳腺癌细胞可以诱导脂肪细胞内的脂解，以允许脂肪酸转移，并启动脂肪细胞中终末分化标志物的丢失。这可以减少脂肪细胞内脂滴的体积，从而减小整体尺寸，并随着去分化的发生而降低脂肪细胞的圆形度。然而，当考虑各种乳腺癌风险因素时，脂肪细胞形态发生了变化。

当按更年期状态分层时，绝经前癌症样本的CAAs小于绝经后样本的CAAs。然而，CAA形状在组间没有差异。CAA大小的差异可能是绝经后女性芳香化酶水平较高的结果，这与脂肪细胞直径呈正相关。三阴性乳腺癌在绝经前更常见，这反映在我们的队列中，80%的绝经前病例为TNBC，而绝经后为61%。TNBC被认为比其他乳腺癌亚型更具侵袭性。因此，TNBC可能诱导绝经前女性更高的脂解速率，以为生长获取更多能量。这可能反映在我们的分析中，因为TNBC样本的脂肪细胞比ER+样本的脂肪细胞更小、更细长。总的来说，额外的样本应有助于更好地了解更年期状态和癌症亚型如何影响脂肪细胞形态，从而影响乳腺癌风险和发展。

脂肪细胞大小通常与BMI增加呈正相关，代表脂肪细胞在较高BMI下为储存过量脂质而发生的肥大。我们的数据显示，在乳腺癌样本中也观察到这一点。然而，在较高BMI组之间未观察到脂肪细胞大小的差异。有报道称，体重正常的人可能代谢性肥胖并具有更大的脂肪细胞。此外，BMI考虑肌肉和去脂体重，这可能会因健身和年龄而变化，可能将代谢健康的人归类为肥胖组。因此，这可以解释为什么在较高BMI组之间未见脂肪细胞大小差异。有趣的是，当考虑形状时，最高BMI的脂肪细胞比最低BMI的脂肪细胞略更细长。这可能是由于肥胖中脂肪组织扩张由脂肪细胞内较高的脂质摄取引起，从而可能将脂肪细胞压缩成更细长的形状。总的来说，我们的数据支持BMI可能不是肥胖水平的准确代表的观点。相反，肥胖还应根据其他更准确的测量方法进行分层，如腰臀比、DEXA扫描甚至皮褶厚度计，以更精确地捕捉肥胖，并更好地了解脂肪分布如何影响脂肪细胞形态，从而可能加强我们发现的有效性。

高MD与脂肪组织减少相关。可以推测，拥有更少的脂肪组织可能导致更小的脂肪细胞，因为随着乳腺密度增加，乳腺癌组织中的脂肪细胞尺寸似乎减小。我们的分析在癌症样本的远处脂肪细胞方面支持这一点，而且在正常样本的脂肪细胞中也支持，表明MD与脂肪细胞大小存在关联，与癌细胞影响无关。关于脂肪细胞形状，来自最致密乳腺的远处癌症脂肪细胞比低密度组的脂肪细胞更细长。致密乳腺中脂肪细胞尺寸减小和形状细长可能是由于较高MD组中纤维腺体组织百分比更高，这可能将脂肪细胞压缩得更小、更细长。鉴于MD和BMI对乳腺癌风险呈负相关，并且我们的结果显示增加MD和BMI均独立与脂肪细胞大小差异相关，因此需要MD和BMI信息均可用的额外样本。这将允许进一步分析这两种风险因素对脂肪细胞形态的联合影响，从而确定将肥胖水平纳入MD分类系统的潜在重要性。

使用来自后来发展为癌症的女性的乳腺组织样本（称为易感）来确定脂肪细胞形态是否可以推断乳腺癌风险。先前报道，与正常组织相比，易感乳腺组织具有显著的脂肪生成和脂肪酸转运基因增加。增加的脂肪生成导致甘油三酯合成增加，引起脂肪细胞对脂质的摄取增加。这可能解释了为什么在我们的研究中，易感乳腺组织中的脂肪细胞比从未有乳腺癌病史或诊断的女性获得的正常乳腺组织中的脂肪细胞更大。有趣的是，这两组脂肪细胞的形状没有差异。然而，易感脂肪细胞比CAAs更凹，表明脂肪细胞形状的变化可能直到癌症 initiation 才发生。不同组织病理学之间看到的脂肪细胞形态差异可能是由于患者表型，因为我们已经证明更年期状态、BMI和MD可以影响脂肪细胞形态。因此，匹配的健康和易感乳腺组织将有助于未来的实验研究，调查脂肪细胞形态改变的潜在原因以及脂肪细胞如何在乳腺癌发生 initiation 中发挥作用。

当脂肪细胞形态参数根据中位数分为小和大时，较小的CAAs与比较大的CAAs更差的生存率相关。癌细胞和脂肪细胞之间的双向串扰可能是一种解释，导致诱导脂肪细胞脂解和脂肪酸向癌细胞的转移。这些脂肪酸可以作为癌细胞的能量来源，可能增强癌细胞生长，并且这种能量可用性的增加可能有助于更差的患者生存。CAAs的形状对生存结局没有显著差异。对于远处脂肪细胞，形状和大小都不影响生存。然而，一个公认的局限性是由于某些病例的元数据不完整，无法进行多变量分析，包括年龄、BMI、MD、癌症亚型和治疗。对额外样本的研究可以为了解在临床环境中使用脂肪细胞形态来帮助评估疾病进展风险和告知患者结局的潜力提供见解。

未来的研究应考虑患者群体的多样性，因为由于已知的脂肪分布和乳腺癌发病率差异，脂肪细胞形态可能在不同种族群体之间有所不同。此外，虽然本研究侧重于女性乳腺组织，但已在男性乳腺癌中证明，诊断数量的上升反映了肥胖水平的上升，脂肪炎症微环境可能是一个促成因素。这项工作可以扩展到使用来自不同风险组、性别和人口统计学的患者的脂肪组织样本进行体外研究，以潜在提高我们对脂肪细胞如何影响乳腺癌发展的理解。

总之，脂肪细胞形态受乳腺内位置、组织病理学和各种乳腺癌风险因素的影响。本研究中使用癌症和正常样本有助于确定风险因素与脂肪细胞形态的关系，无论有无癌细胞的影响，从而为理解乳腺癌细胞和相关风险因素影响脂肪细胞大小和形状的程度提供了基线。在正常样本中，脂肪细胞形态受MD差异的影响更强烈，邻近脂肪细胞大小随着乳腺密度增加而减小。然而，在乳腺癌样本中，邻近脂肪细胞形态受更年期状态和BMI的影响更强烈，绝经前样本的CAAs比绝经后样本更小，并且CAAs大小与BMI呈正相关。考虑到脂肪细胞形态的差异，乳腺癌风险因素可能影响CAAs对乳腺癌发生的贡献。总的来说，本研究强调了研究正常样本并将患者特异性结局纳入脂肪细胞在乳腺癌发展和进程中作用的研究的重要性。

方法

研究人群

从5个生物样本库获得苏木精-伊红染色组织切片的数字全切片图像。从最初确定的537例病例中，331例符合纳入标准并纳入分析。本研究中包括的所有样本均为非特殊类型浸润性乳腺癌或未注明类型。

感兴趣区域的识别和脂肪细胞的分割

每个H&E染色的WSI上传到QuPath开源软件。应用500μm×500μm网格，并选择大约5个包含邻近脂肪细胞和5个包含远处脂肪细胞的ROI。对于正常乳腺和对侧组织样本，邻近脂肪细胞被认为是距离乳腺上皮细胞≤2mm的区域，远处脂肪细胞为>2mm away。这些距离的选择是为了保持样本间的一致性。与癌症样本类似，在整个图像上选择每个邻近和远处脂肪细胞的五个区域，以确保分析代表整个组织样本。

ROI图像导出到ImageJ并使用开源Adiposoft插件进行分析。Adiposoft自动分割脂肪细胞，排除图像边缘的脂肪细胞。选择30μm?500μm的直径范围以避免伪影，如导管和血管的管腔。清除背景并填充脂肪细胞注释，然后将图像转换为8位二值图像，这是ImageJ Particles8插件的前提。

形态特征分析

Adiposoft分割生成了大量脂肪细胞。使用Particles8插件分析二值图像。基于先前文献，从每个脂肪细胞计算了最具生物学信息性的参数。在7个参数中，进一步评估了周长、面积、凹度和纵横比，因为这些是代表脂肪细胞形态的最具描述性的参数。使用比例尺将测量值从像素转换为微米。计算每个ROI每个参数的中位数。

统计分析和重要参数的识别

进行了随机森林分析，以确定Particles8分析中7个生物学信息性参数中哪些对于评估脂肪细胞形态最重要。文献表明面积和直径是大小最常用的描述符。鉴于周长是模型中最高的大小参数，它被用来描述脂肪细胞大小，并与面积一起与现有文献进行比较。凹度是模型中最重要的形状参数，因此在本研究中使用。去除面积、周长或凹度意味着模型将脂肪细胞分类为邻近或远处的整体准确性和可靠性显著降低。尽管纵横比在模型中重要性较低，但本研究中使用它，因为它使用7个生物学信息性参数中的两个计算，并提供了脂肪细胞是圆形还是更像CAAs细长的见解。

使用Shapiro Wilk正态性检验，然后进行Kruskal-Wallis H检验和Dunn多重比较检验来确定脂肪细胞形态的统计学差异。p值≤0.05被认为具有统计学显著性。使用Graph Pad Prism进行统计检验和绘图。

伦理批准

四个生物样本库的伦理批准已涵盖：Susan G. Komen Tissue Bank, NHS Grampian Biorepository, Breast Cancer Now Biobank, and The Leeds Breast Tissue Bank。开源The Cancer Genome Atlas不需要伦理批准，因为从TCGA获得的图像来自完全匿名患者的公开可用数据集。