外泌体在原发性骨质疏松症治疗中的机制与应用前景：靶向骨代谢微环境的新策略

本综述系统阐述了外泌体（Exosomes）作为细胞间通讯的关键媒介，通过调控成骨细胞-破骨细胞偶联、氧化应激及免疫微环境等机制，在原发性骨质疏松症（Primary Osteoporosis）治疗中展现的巨大潜力。文章整合了其作为天然药物递送系统的优势、临床前研究进展，并指出了标准化生产、靶向性优化等未来转化面临的挑战与方向。

　　

引言

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征的代谢性骨病，其主要原因是骨吸收和骨形成过程的失衡。原发性骨质疏松症，特别是绝经后和老年性变体，已成为日益重要的全球公共卫生问题。传统治疗方法，如双膦酸盐和激素替代疗法，虽然显示出一定的有效性，但其应用受到显著副作用和靶向特异性欠佳的限制。因此，开发创新的治疗策略已成为研究重点。近年来，外泌体——细胞释放的微小膜结合囊泡——因其独特的生物学特性，在治疗骨质疏松症方面显示出巨大潜力。

几乎所有类型的细胞都能产生外泌体，它们携带包括蛋白质、脂质和核酸在内的生物活性分子，是细胞间通讯的重要组成部分。研究表明，它们通过调节成骨细胞和破骨细胞的活性以及骨代谢稳态，在骨质疏松症的发病机制和进展中发挥着重要作用。此外，外泌体有潜力作为天然药物递送系统，运输治疗剂进行靶向治疗，这为克服传统疗法的局限性提供了一种新策略。

尽管在外泌体基础研究方面取得了显著进展，但其临床应用仍面临一些障碍，包括缺乏标准化的分离纯化方案、显著的异质性以及长期安全性的进一步验证。未来的研究工作应致力于阐明外泌体功能的潜在机制，并优化其生产和递送方法，从而促进其在骨质疏松症治疗中的转化应用。

外泌体在原发性骨质疏松症基础研究中的应用

为了阐明细胞背景，我们按骨相关靶细胞组织基础研究证据，并总结具有代表性的外泌体来源、通路和功能结果。

对成骨细胞/前成骨细胞的影响

骨髓基质细胞（BMSC）来源的外泌体递送成骨性微RNA（microRNAs），可增强成骨细胞增殖和分化，上调Runt相关转录因子2（RUNX2）和Osterix，并激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路；它们还能减少细胞凋亡并增加矿化。来自肌源性外泌体的额外证据表明其对体内成骨细胞功能具有支持作用。这些发现将成骨细胞谱系细胞定位为外泌体介导的成骨作用的直接效应器。

对破骨细胞及成骨细胞-破骨细胞串扰的影响

破骨细胞来源的外泌体调节长链非编码RNA（lncRNA）AW011738/miR-24-2-5p/髓细胞触发受体1（TREM1）轴，影响成骨分化和骨量，这强调了骨吸收和骨形成之间的双向耦合。通过外泌体 cargo 靶向该轴为重新平衡原发性骨质疏松症中的骨重塑提供了一条途径。

对间充质干细胞（MSCs）的影响

经成骨诱导的人脐带间充质干细胞（HucMSC）外泌体富含与MAPK和破骨细胞分化通路相关的微RNA，从而促进MSC成骨，并改善雌激素缺乏模型中的骨密度。年轻供者血浆外泌体进一步增强了MSC的增殖和迁移、碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化，其中miR-142-5p作为关键效应因子。植物来源的外泌体样纳米囊泡（PELNs）通过增强自噬和调节肠道代谢物/微生物群促进人骨髓来源的间充质干细胞（hBMSC）成骨。

对内皮细胞和血管生成的影响

内皮祖细胞（EPC）来源的外泌体通过miR-126介导的SPROUTY相关EVH1结构域包含蛋白1（SPRED1）抑制和快速加速纤维肉瘤/细胞外信号调节激酶（Raf/ERK）激活，刺激内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成，在牵张成骨过程中增加血管密度和骨再生。内皮来源的外泌体还能通过限制铁死亡（ferroptosis）相关损伤来减轻糖皮质激素诱导的骨质疏松症。

对免疫细胞/巨噬细胞的影响

骨髓基质细胞（BMSC）来源的外泌体通过三方基序包含蛋白25（TRIM25）驱动M2巨噬细胞极化，抑制炎症信号，并增强去卵巢（OVX）模型中的骨形成。经预处理的M2巨噬细胞外泌体激活β-连环蛋白（β-catenin）以刺激MSC成骨并加速骨缺损修复。

其他靶点及微环境背景

肌源性外泌体在肌肉减少症相关的骨质疏松中部分促进成骨，突出了肌肉-骨轴通讯。在高血糖/糖尿病环境下，脂肪来源的间充质干细胞（AD-MSC）外泌体抑制NOD样受体家族pyrin域包含蛋白3（NLRP3）炎症小体并减少骨丢失。

总的来说，这些细胞类型特异性效应阐明了外泌体如何在原发性骨质疏松症中调节骨微环境，并为转化研究中的靶点选择提供了信息。

原发性骨质疏松症的病理机制及外泌体的作用

原发性骨质疏松症的发病机制主要归因于骨代谢失衡，其特征是骨吸收相对于骨形成过度，最终导致骨量减少和骨微结构破坏。外泌体在这一病理过程中扮演多方面的调节角色。从细胞间通讯的角度看，外泌体通过介导细胞间的信号和物质传递参与骨代谢的调节。在骨重塑过程中，外泌体不仅传递促进成骨和骨吸收的信号，还调节骨重塑细胞的分化、募集和活性。此外，它们已被证明直接有助于细胞外基质矿化。研究表明，破骨细胞来源的外泌体通过lncRNA AW011738/miR-24-2-5p/TREM1轴影响成骨细胞分化，从而在骨质疏松症进展中发挥作用。此外，外泌体与氧化应激和细胞凋亡等多种病理过程密切相关。氧化应激被认为是骨质疏松症的一个关键致病因素，外泌体包裹的微RNA能够调节这种反应，从而影响疾病进展。例如，内皮细胞来源的外泌体（EC-Exos）通过抑制铁蛋白吞噬依赖性铁死亡来减轻糖皮质激素诱导的骨质疏松症。另外，间充质干细胞（MSCs）来源的外泌体通过多种信号通路在骨代谢中发挥重要作用。经成骨诱导的HucMSC来源的外泌体富含调节骨形成和分化关键信号通路的微RNA，包括破骨细胞分化和MAPK通路，从而影响骨质疏松症。 collectively，这些发现阐明了外泌体在原发性骨质疏松症发病机制中介导的复杂调控网络，并为理解该疾病的潜在机制提供了新的见解。

外泌体在骨质疏松症动物模型中的实验研究

在骨质疏松症动物模型中，外泌体的治疗潜力和潜在机制已得到广泛研究。例如，在模拟绝经后骨质疏松症的OVX大鼠模型中，大量研究表明，来自不同来源的外泌体在减轻骨丢失方面发挥有益作用。在OVX小鼠模型中，BMSC来源的外泌体通过TRIM25介导的M2巨噬细胞极化促进成骨，从而增强骨形成并改善骨微结构。此外，从年轻和老年健康个体血浆中分离的外泌体被观察到可增强MSC的增殖和迁移，增加ALP活性，促进MSC矿化，并减少破骨细胞数量。在OVX诱导的骨质疏松大鼠模型中，来自年轻健康个体的血浆来源外泌体显示出优于其他来源的对骨组织的保护作用。另外，对HucMSC来源的外泌体，特别是成骨诱导后的功能特性进行了研究。经成骨诱导的外泌体（Exo2）显示出比标准培养条件来源的外泌体（Exo1）更强的促成骨分化作用。Exo1和Exo2均能有效提高胫骨骨密度并逆转雌激素缺乏小鼠模型的骨质疏松症。此外，AD-MSC来源的外泌体通过抑制NLRP3炎症小体的激活和减轻骨丢失，在糖尿病骨质疏松症中显示出治疗潜力。

此外，MSC来源的外泌体已显示出显著的治疗潜力。将MSC来源的外泌体注射到OVX小鼠模型中，通过微型计算机断层扫描（micro-CT）、组织学和免疫组织化学分析证明，可导致骨形成增强和骨微结构改善。进一步的研究表明，这些作用可能是通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路介导的，该通路促进成骨细胞的增殖和分化，从而发挥抗骨质疏松作用。另外，骨骼肌来源的外泌体在骨质疏松症治疗中也显示出前景。从经历神经肌肉电刺激（DN+ES-Exo）的失神经骨骼肌中分离的外泌体被给予患有肌肉减少症相关骨质疏松症的大鼠。体外共培养实验表明，这些外泌体在体内和体外部分促进了成骨作用。总的来说，这些动物研究为外泌体疗法治疗原发性骨质疏松症的转化潜力提供了重要的临床前证据。

外泌体在原发性骨质疏松症治疗中的应用

外泌体介导的药物递送系统

外泌体作为内源性纳米级转运体，在骨质疏松症管理的药物递送方面展现出显著优势。它们优异的生物相容性、低免疫原性以及穿透生物屏障的能力，有助于运输多种生物活性分子——包括蛋白质、核酸和脂质——从而在细胞间通讯中发挥关键作用。在骨质疏松症治疗的框架内，外泌体调节与骨代谢相关的细胞间信号，并影响成骨细胞和破骨细胞的活性，因而显示出巨大的诊断和治疗潜力。此外，外泌体可以作为递送骨质疏松症特异性治疗剂或遗传物质的载体，从而提高药物的靶向性和疗效。研究表明，可以利用电穿孔和超声等方法将雌激素载入外泌体内部或表面，用于靶向治疗骨质疏松症。特别是，利用孵育和超声辅助技术开发了来自BMMSCs的雌激素负载外泌体，并评估了它们对BMMSC存活率的影响。研究结果表明，载药外泌体显著增强了BMMSC的存活率，同时保持了外泌体特有的球形形态。

此外，通过修饰表面配体，外泌体能够实现向特定细胞类型的靶向递送，这是近期研究备受关注的一个课题。研究表明，将特定的糖胺聚糖或其他配体锚定在外泌体表面可以显著增强其靶向能力，从而实现更精确的药物递送。外泌体表面的功能化可以通过多种方法实现，包括基因工程、共价修饰和非共价相互作用。例如，可以利用基因工程在外泌体表面表达特定的靶向分子，从而增强体内靶向性和治疗效果。或者，化学修饰可以引入增加与靶细胞结合亲和力的官能团。在癌症治疗领域，表面工程化的外泌体已被广泛用于增强药物靶向性。这种基于外泌体的药物递送策略为治疗原发性骨质疏松症提供了一种精确有效的方法，并在克服传统递送方法的局限性方面显示出巨大潜力。

外泌体在骨再生中的作用机制

外泌体在骨再生中起着不可或缺的作用，涉及多种潜在机制。首先，外泌体促进成骨细胞的增殖和分化。经验证据表明，来自BMSCs的外泌体通过递送特定的微RNA（如miR-150-3p）来增强成骨细胞的增殖和分化。这些外泌体调节关键转录因子（包括Runx2和Osterix）的表达，从而增强成骨细胞功能，并为骨质疏松症提供治疗潜力。其次，BMSC来源的外泌体通过抑制成骨细胞凋亡来促进骨质疏松症的缓解。这些外泌体显著提高成骨细胞活力并降低凋亡相关基因的表达水平，从而促进成骨细胞增殖。此外，外泌体通过调节MAPK信号通路刺激成骨细胞增殖。研究表明，BMSC来源的外泌体上调MAPK通路相关蛋白的表达，从而通过细胞周期促进成骨细胞生长和进程。

相反，外泌体在调节血管生成中不可或缺，这一过程对于提供骨再生所需的营养和氧气至关重要。内皮祖细胞（EPC-Exos）来源的外泌体已被证明能增强血管内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成，从而促进血管生成。在大鼠牵张成骨模型中，局部施用EPC-Exos被观察到可加速骨再生并增加血管密度。这种效应与EPC-Exos介导的、依赖于miR-126的SPRED1下调和Raf/ERK信号通路的激活密切相关。此外，外泌体通过调节免疫微环境在骨再生中发挥关键作用。具体来说，巨噬细胞来源的外泌体可以通过调节炎症反应和引导免疫细胞极化来促进骨愈合，从而营造再生环境。值得注意的是，来自用硫化氢（H₂S）预处理的M2巨噬细胞的外泌体已被证明可通过激活β-连环蛋白信号通路增强MSC的成骨分化，从而促进颅骨缺损的修复。这些协同机制强调了外泌体在骨再生和原发性骨质疏松症相关骨缺损修复中的巨大治疗潜力。

外泌体与现有治疗策略的协同效应

在原发性骨质疏松症的管理中，将外泌体与现有治疗模式相结合，为改善临床结果提供了一种创新方法。从药理学协同作用的角度看，外泌体可以作为药物递送载体，与传统的抗骨质疏松药物（如双膦酸盐和甲状旁腺激素（PTH））联合使用。双膦酸盐通过抑制破骨细胞活性和减少骨吸收起作用，而外泌体有助于将这些药物精确递送至骨质疏松部位。这种靶向递送不仅提高了药物疗效，还减少了全身分布和相关不良反应。经验证据表明，负载双膦酸盐的外泌体能更有效地抑制破骨细胞的分化和活性，同时促进成骨细胞的增殖和分化。与单独使用双膦酸盐相比，这种联合策略在骨质疏松动物模型中导致骨量显著增加。

在与物理疗法协同的背景下，电刺激是一个重要的例子。来自经过电刺激预处理的BMSCs的外泌体（称为Elec-exo）在骨修复中表现出增强的再生能力。电刺激诱导BMSC来源外泌体的蛋白质和基因表达谱发生变化，富集了与氧化磷酸化相关的蛋白质，并激活了与骨形成相关的通路，如PI3K-Akt和MAPK。当将Elec-exo封装在硫酸软骨素甲基丙烯酸酯（CSMA）水凝胶中并应用于大鼠股骨缺损模型时，它显著加速了早期骨再生。这种联合治疗产生的效果优于单独的物理刺激或外泌体疗法。这种将外泌体与现有治疗模式相结合的协同策略，优化了每种方法的优势，并为原发性骨质疏松症患者提供更有效的治疗选择带来了巨大希望。

与当前标准疗法的比较

尽管传统的抗骨质疏松药物在一定程度上有效，但其长期使用往往伴随着不良副作用，限制了其广泛的临床应用。虽然已有指南认可的抗骨吸收剂（例如，口服或静脉注射双膦酸盐、地诺单抗）和合成代谢剂（例如，特立帕肽、阿巴洛帕肽、罗莫索单抗）可用，但它们在现实实践中的有效性受到长期依从性挑战以及不良事件（如胃肠道不耐受、低钙血症、颌骨坏死和非典型股骨骨折）的限制。在某些情况下，突然停药甚至可能引发反跳性椎体骨折（例如，地诺单抗）。此外，个体化的序贯或联合策略仍然定义不足，突显了在特异性、安全性和获益持久性方面未满足的需求。

近年来，外泌体已成为一种有前景的治疗策略，因其天然来源、选择性、适应性和副作用极小而备受关注。外泌体在骨质疏松症中的治疗优势在于其能够调节骨代谢关键细胞（如成骨细胞和破骨细胞），从而促进骨形成并抑制骨吸收，以改善骨密度和微结构。除了其作为囊泡载体的既定作用外，外泌体还提供具有低免疫原性的无细胞递送、对不稳定 cargo 的内在保护以及与可扩展生物加工和质量控制框架的兼容性。它们适用于靶向工程方法（例如，表面配体展示或 cargo 加载），以增强向骨微环境的归巢，调节成骨细胞-破骨细胞串扰和抗氧化反应，并增强与原发性骨质疏松症相关的成骨合成代谢信号通路。

虽然标准疗法有大量临床试验数据支持，但外泌体策略在很大程度上仍处于临床前阶段，迄今为止尚未完成针对骨质疏松症的人体研究。因此，外泌体目前应被视为现有药物的潜在辅助手段而非替代品，为解决安全性、持久性和组织特异性方面未满足的需求提供了一个有前景的途径。

原发性骨质疏松症外泌体疗法的进展

外泌体分离纯化技术的最新进展

外泌体的分离和纯化是其骨质疏松症治疗应用的基本前提。传统方法，包括超速离心、密度梯度离心和基于聚合物的沉淀法，已被广泛使用。然而，这些技术受到一些限制的困扰，例如处理时间长、纯度不理想和产量有限。为了应对外泌体研究和临床应用日益增长的需求，近年来开发了创新的分离和纯化技术。

微流控技术因其高通量、高分辨率和样品消耗少的特点而成为一种有前景的方法。通过在微通道内设计特定的物理或化学环境，微流控技术有助于外泌体的高效分离和富集。例如，利用微流控芯片中的惯性聚焦和筛分效应，可以根据外泌体的大小和形状实现精确分离，从而显著提高分离效率和纯度。此外，免疫亲和捕获技术利用抗体与外泌体表面标记物之间的特异性结合相互作用来实现选择性分离。虽然这种方法可以进一步提高外泌体纯度，但它需要根据外泌体来源仔细选择合适的标记物和抗体，并且通常成本较高。同时，基于纳米材料的分离方法引起了相当大的关注。通过利用纳米颗粒与外泌体之间的相互作用，这些方法有助于快速分离和富集，具有简单高效的优点。微流控技术因其精确的微尺度操纵和自动化潜力，已成为外泌体分离领域的重要候选技术。其无标记分离技术不仅简化了操作程序，减少了时间和成本，而且有效地保护了外泌体的生物活性。然而，现有的微流控平台在处理临床样本时遇到了一些挑战和限制。除了微流控技术，聚乙二醇（PEG）沉淀法因其高产量和成本效益而仍然是一种流行的方法。尽管在纯度方面存在某些限制，但PEG沉淀法的便利性和产率使其成为研究人员青睐的方法。将PEG沉淀法与其他分离技术相结合可以进一步提高外泌体分离的效率和纯度。

基于外泌体的药物递送系统在骨质疏松症治疗中的应用

外泌体作为内源性纳米级载体，表现出显著的生物相容性、最小的免疫原性和强大的细胞靶向能力，表明在药物递送应用中具有巨大潜力。在骨质疏松症治疗的背景下，基于外泌体的药物递送系统能够将治疗剂精确运输至病变部位，从而提高药物疗效并减少副作用。研究人员通过将雌激素封装在BMMSC来源的外泌体内，开发了一种靶向药物递送系统。这种方法不仅保留了外泌体的固有特性，还显著增加了雌激素在骨组织中的积累，支持BMMSC存活，从而改善了骨质疏松症的治疗效果。此外，在一些研究中，各种抗骨质疏松药物，包括辛伐他汀和淫羊藿苷，已被封装在外泌体内。这些药物的外泌体介导递送已显示出提高的生物利用度和靶向效率，从而增强了它们对抗骨质疏松症的疗效。尽管基于外泌体的药物递送代表了一种有前景的骨质疏松症治疗新策略，但在载药效率低、以及载药外泌体的稳定性和靶向能力方面仍然存在挑战。这些方面需要进一步优化。

原发性骨质疏松症外泌体疗法的未来展望

外泌体疗法临床应用的挑战

尽管外泌体疗法治疗骨质疏松症潜力巨大，但其临床应用受到若干挑战的阻碍。首先，外泌体的生产和分离技术尚未完全标准化，导致临床环境中的一致性和可重复性存在问题。当前的分离方法通常纯度和效率较低，从而限制了外泌体的更广泛应用。外泌体的异质性仍然是临床转化的一个主要障碍，因为细胞来源、培养条件和分离技术的差异导致批次间差异。这种差异性影响了 cargo 含量、靶向效率和治疗可预测性。尽管最近在单囊泡分析和高通量RNA测序方面的进展可能提供潜在的解决方案，但这些技术仍需要标准化以获得监管批准。为了增强外泌体的治疗效果，研究人员正在研究工程化修饰以优化其靶向能力和载药能力。在癌症治疗领域，由于外泌体低免疫原性和高生物相容性，它们越来越被认为是一种有前景的药物递送系统，这有助于在体内安全运输治疗剂。然而，提高外泌体的载药效率和靶向特异性仍然是一个重要的研究领域。此外，外泌体在癌症免疫治疗中的应用引起了相当大的关注，因为它们作为天然免疫调节剂能够增强抗肿瘤免疫反应。尽管存在这些挑战，外泌体的临床转化潜力仍然广阔。持续优化生产和分离方法，结合对其生物学功能和机制的全面研究，可能使外泌体在再生医学、癌症治疗和其他领域发挥关键作用。未来的研究必须持续强调标准化生产、优化靶向性以及外泌体疗法在各种疾病中的应用，以促进成功的临床转化。此外，对外泌体疗法的长期安全性和有效性进行全面调查至关重要。大多数现有研究主要依赖于动物模型和短期临床试验，其在人类中的长期效应——如潜在的免疫反应或致瘤风险——仍未得到充分了解。克服这些挑战需要多学科合作，整合材料科学、生物学、医学及相关领域的专业知识，共同推动基于外泌体的疗法的临床转化。

外泌体疗法未来研究方向

未来的工作应优先考虑具体、可测试的步骤，以推动外泌体疗法向临床转化，而不是重复现有的障碍。分离、表征和效力测定的标准化方案对于确保可重复性和监管合规性至关重要，并且需要改进大规模制造技术以生产质量稳定的外泌体。例如，进一步阐明外泌体内特定微RNA（miRNAs）、长链非编码RNA（lncRNAs）和蛋白质对成骨细胞和破骨细胞功能的调控网络，将为设计具有增强靶向能力的外泌体疗法提供理论基础。

相反，一个重要的研究领域是优化外泌体制备和递送技术。开发标准化和高效的大规模生产方法对于提高外泌体产量和确保质量稳定性至关重要。同时，外泌体靶向和递送技术的进步对于提高向骨组织和特定细胞类型的特异性和递送效率，同时最大限度地减少对非靶组织的影响至关重要。有比较对象锚定的早期阶段研究将阐明其定位，并支持后续具有临床意义结果的随机试验。通过在这些领域全面的研究工作，外泌体疗法有望成为治疗骨质疏松症的有效策略。

结论

基于外泌体的原发性骨质疏松症治疗方法在细胞和动物模型中显示出令人鼓舞的临床前疗效，其机制包括增强成骨合成代谢信号、调节破骨细胞活性以及减轻氧化应激。其转化潜力取决于对来源选择、分离和表征、cargo 加载以及释放标准的严格标准化，以及可靠的生物分布、靶向性和安全性评估。目前的证据在不同实验室间仍存在异质性，一些研究报告了有限或无效果，这强调了需要统一方案和剂量标准化。优先的后续步骤包括与标准药物的头对头比较、机制与产品的对齐（包括靶向策略和质量控制）、经过验证的药效学生物标志物，以及旨在评估安全性和初步有效性的早期临床试验。总体而言，外泌体是现有疗法有前景的辅助手段而非即时替代品，重点的转化工作将决定它们在原发性骨质疏松症中的临床价值。