全基因组CRISPR筛选揭示剪接因子SF3B4驱动肝细胞癌的新机制及其在乐伐替尼耐药中的作用

本研究利用患者来源的肝癌类器官进行全基因组CRISPR敲除筛选，旨在系统性鉴定肝癌生存必需基因及乐伐替尼耐药的关键调控因子。研究人员发现剪接体因子SF3B4是肝癌进展的核心驱动基因，其通过调控TBX3+2a剪接变体促进肿瘤发生；同时揭示GCLC介导的抗铁死亡通路是乐伐替尼耐药的重要机制。该研究为肝癌治疗提供了新的靶点和联合治疗策略。

　　

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，由于其发病隐匿且进展迅速，多数患者确诊时已属晚期。对于不可切除的晚期患者，系统性治疗是主要选择。乐伐替尼（lenvatinib）作为美国FDA批准的一线治疗药物，虽然显示出良好的临床效果，但耐药问题日益凸显。理解乐伐替尼耐药的生物学基础并识别相关生物标志物，对于开发乐伐替尼联合治疗方案至关重要。

高通量测序技术已经揭示了HCC的基因组和转录组蓝图，并识别出许多癌症相关基因。然而，从海量基因中阐明它们在致癌过程中的因果作用仍然是一项艰巨的任务。全基因组筛选为表型分析和鉴定驱动肿瘤发生及耐药的关键基因提供了宝贵策略。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）为基础的筛选已被广泛应用于阐明基因型与表型之间的因果联系。类器官技术因其与患者遗传相似性高且能模拟许多生物学特征而展现出临床相关性。

在此背景下，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了题为“Genome-wide CRISPR screen identifies splicing factor SF3B4 in driving hepatocellular carcinoma”的研究论文。该研究利用患者来源的肝癌类器官（PDO）进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除（KO）筛选，旨在系统性鉴定（i）HCC的生存必需基因和（ii）乐伐替尼耐药的调控基因。

研究人员主要运用了几项关键技术：首先，建立了保留原发肿瘤组织病理学和遗传特征的患者来源肝癌类器官（PDO）模型；其次，利用人全基因组CRISPR敲除文库（GeCKOv2）在类器官中进行功能性筛选；第三，结合了RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）、长读长异构体测序（Iso-seq）和转录组测序（短读长）等多种组学技术来解析SF3B4调控的剪接景观；第四，通过小鼠水动力学尾静脉注射（HDTVi）模型在体内验证基因功能；最后，利用类器官衍生异种移植（ODX）模型评估了靶向剪接体或铁死亡通路的治疗策略。临床样本队列来源于香港威尔士亲王医院。

研究结果

Genome-wide CRISPR-Cas9 KO screen in patient-derived HCC organoid

研究人员直接从患者的HCC组织培养建立了PDO H813Torg，该模型保留了原发肿瘤的组织病理学和遗传特征。使用人GeCKO（Genome-Scale CRISPR Knockout）混合文库，在H813Torg中进行了筛选。筛选结果显示出高映射比、近乎完全的sgRNA覆盖度和良好的可重复性。通过检查预定义的高置信度核心必需基因和非必需基因的行为，验证了筛选结果的可靠性。

Spliceosome factor SF3B4 is essential for HCC survival

筛选共鉴定出1470个在四个KO筛选重复中一致负选择的必需基因。顶级必需基因显著富集于DNA复制、蛋白质合成和细胞周期等生物学过程。剪接体（Spliceosome）的参与尤为突出，有29个剪接调控因子在CRISPR筛选中显示出显著选择。这些基因在内部和TCGA-LIHC的HCC转录组数据集中均持续上调。其中，剪接因子SF3B4（splicing factor 3b subunit 4）在HCC中表现出明显的过表达，其表达水平与较差的患者生存率相关。在独立队列中通过qPCR和免疫印迹证实了SF3B4在mRNA和蛋白水平的表达上调。作为KO筛选的独立功能验证，SF3B4敲低诱导了HCC PDOs（H813Torg和H688Torg）的自发性细胞死亡。

SF3B4 promotes premalignant features in hepatic organoids and HCC formation in vivo

接下来，研究人员在两个正常肝脏类器官（Liver.Org1和Liver.Org2）中过表达SF3B4以评估其致癌性。稳定过表达SF3B4诱导了两种肝脏类器官的形态转化，类器官变得囊性减少、更不规则，形成由多个细胞层组成的厚壁，并表现出许多癌前特征。特别是，SF3B4过表达的类器官能显著延长体外寿命至35周以上，而载体对照在大约18周后停止生长。除了生长优势外，Ki67的免疫组织化学染色进一步显示SF3B4过表达类器官的增殖指数增加。转录组分析显示，SF3B4改变的基因显著富集于HCC的干细胞亚类。一致地，观察到干性标志物SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX9)和Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM)的表达升高，表明干细胞样特征增强。为了在体内进一步检验SF3B4的作用，研究人员采用了小鼠水动力学尾静脉注射（HDTVi）模型来模拟原位HCC形成。研究发现，虽然对照组显示50%的肿瘤形成率，但SF3B4的存在将HCC发生率大幅提高至所有小鼠（100%）。SF3B4诱导的HCC结节在肿瘤体积上也显著增大。

SF3B4 alters mRNA splicing pattern

为了理解SF3B4如何刺激肝脏致癌性，研究人员在过表达SF3B4或对照的Liver.Org1中进行了免疫共沉淀偶联液相色谱/质谱（IP-LC/MS）、RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）、长读长Iso-seq（PacBio SMRT）和短读长转录组测序。IP-LC/MS在SF3B4下拉产物中鉴定出166个显著富集的蛋白，这些SF3B4结合蛋白主要参与RNA剪接过程和代谢，顶级蛋白是剪接体成分或RNA剪接调控因子。RIP-seq进一步探究了SF3B4-RNA相互作用，共识别出114,286个注释的RNA峰，表明是SF3B4结合区域。结合长读长Iso-seq和短读长转录组测序的混合RNA-seq分析定义了mRNA剪接模式，强调SF3B4主要调控 cassette exon（盒式外显子）的剪接事件，涉及成熟mRNA的外显子跳跃（40.98%）和外显子包含（31.26%）。值得注意的是，在转录本 percent spliced-in (PSI, 剪接百分比) 的增加和转录本表达的增强之间发现了强烈的正相关，表明SF3B4对转录本异构体生成有直接调控作用。分析鉴定出748个在SF3B4过表达组中剪接 dPSI（delta PSI）显著增加（>0.1）的转录本，这些转录本富集于转录因子结合和DNA结合活性。

TBX3+2a, a downstream effector of SF3B4

数据表明SF3B4可能参与增强转录因子的剪接变体。TBX3+2a在SF3B4过表达存在下显示出显著表达，并且排名靠前。TBX3是T-box家族的转录因子，其异构体TBX3+2a由外显子包含产生。研究发现TBX3+2a在SF3B4存在下优先表达。在一组原发性HCC肿瘤（n=41）中的qPCR验证证实了TBX3+2a与SF3B4表达之间存在显著正相关，而这种关联在TBX3中不明显。对RIP-seq数据的详细分析显示SF3B4在TBX3基因上有富集结合，特别是明显的占据定位于外显子2a附近。通过RIP-qPCR可以轻易证明与TBX3的强亲和力，显示在pull-down产物中TBX3 mRNA与SF3B4蛋白的富集显著。通过半定量PCR进一步证实了变体TBX3+2a的增加。在Liver.Org1和Liver.Org2中，SF3B4过表达使TBX3+2a:TBX3比率提高了两倍以上，这对应于qPCR检测中TBX3+2a mRNA的明显增加。在敲低实验中也证明了SF3B4与TBX3+2a之间的直接联系，在HCC PDO H688Torg中沉默SF3B4表达导致TBX3+2a水平降低。为了进一步支持SF3B4在介导TBX3+2a剪接中的调控作用，研究人员使用反义寡核苷酸（ASO）破坏SF3B4与TBX3+2a前体mRNA之间的相互作用。这种破坏导致TBX3+2a:TBX3比率显著下降，表明SF3B4结合是TBX3+2a正常表达所必需的。此外，微小基因报告基因 assay的结果显示，敲低SF3B4显著降低了TBX3外显子2a包含的效率，导致长形式微小基因减少。为了评估TBX3+2a的功能贡献，研究人员使用了设计用于特异性靶向TBX3+2a同时保持经典TBX3表达的shRNAs。这种对TBX3+2a的靶向抑制导致SF3B4过表达肝脏类器官出现明显的生长停滞，表明该异构体在SF3B4介导的细胞生长中起关键作用。为了探索操纵剪接 machinery 在HCC治疗中的转化影响，研究人员调查了SF3B4与乐伐替尼耐药（HCC管理中的主要临床挑战）之间的关系。值得注意的是，SF3B4敲低使耐乐伐替尼的PDO模型H813Torg对该药物敏感。此外，乐伐替尼处理在多个PDO系中诱导了SF3B4的剂量依赖性上调，表明可能存在正反馈回路。为了进一步评估治疗潜力，研究人员使用H3B-8800（一种SF3B复合物的调节剂）进行了体内异种移植实验。H3B-8800作为单一疗法和与乐伐替尼联合使用进行了测试。结果显示，H3B-8800显著抑制肿瘤生长，并在类器官衍生异种移植中与乐伐替尼产生协同效应，提示了与当前标准疗法的有效组合策略。

CRISPR screen revealed GCLC-driven antiferroptosis in lenvatinib resistance

除了核心必需基因，研究人员还探索了导致乐伐替尼耐药的基因，这是HCC患者接受这种一线药物时常见的现象。研究人员调整了全基因组CRISPR-Cas9筛选策略，在H813Torg中加入了药物处理或未处理的对照组，为期7天的筛选期。研究发现423个基因在乐伐替尼处理组中被优先负选择，其中排名最高的是铁死亡（ferroptosis）抑制因子。观察到靶向GCLC、FURIN、BRD3、NQO1和FTL的sgRNA出现显著的负选择。这些铁死亡抑制因子的表达增加与接受乐伐替尼治疗后疾病进展（PD）的HCC患者缺乏反应相关。作为KO筛选的独立验证方法，研究人员在H813Torg中稳定敲低了这五个基因的表达，并重新评估了PDO对乐伐替尼的反应。与筛选数据一致，下调GCLC、FURIN、BRD3、NQO1和FTL使H813Torg对乐伐替尼重新敏感。有趣的是，SF3B4敲低后对乐伐替尼的重新敏感伴随着铁死亡的激活，支持了铁死亡与HCC中对乐伐替尼反应性之间的机制联系。鉴于GCLC排名第一，研究人员进一步研究了其在乐伐替尼耐药中的作用。在另一个耐乐伐替尼的HCC PDO H688Torg中，研究人员证实消除GCLC表达 readily 降低了乐伐替尼的IC50值。相反，在药物应答的PDO H744Torg中GCLC过表达增强了对乐伐替尼的耐药性。为了研究GCLC在体内的作用，缺乏GCLC表达的H813Torg类器官衍生异种移植在乐伐替尼治疗后显示肿瘤缩小，而空载体对照仍然耐药。shGCLC对H813Torg和H688Torg的作用对应于在乐伐替尼存在下铁死亡指标CHAC1和SLC7A11的上调以及脂质过氧化。此外，在H813Torg和H688Torg中观察到乐伐替尼对GCLC表达的剂量依赖性诱导，表明GCLC的反馈上调限制了HCC对乐伐替尼的反应。在确定GCLC介导的铁死亡抑制有助于乐伐替尼耐药后，研究人员接下来评估铁死亡诱导剂是否可以恢复药物敏感性。用咪唑酮伊拉斯汀（IKE，一种明确的铁死亡诱导剂）治疗导致HCC肿瘤在体内对乐伐替尼显著重新敏感。一致地，L-丁硫氨酸-亚砜亚胺（BSO，一种GCLC抑制剂）也增强了类器官衍生异种移植中对乐伐替尼的敏感性，进一步支持了抗铁死亡通路介导HCC乐伐替尼耐药的结论。

研究结论与意义

全基因组CRISPR-Cas9功能性筛选已成为加速先前未识别的癌症发现的强大技术。本研究首次在直接源自患者肿瘤组织的真实HCC类器官H813Torg中进行了CRISPR-Cas9筛选。通过两次全基因组筛选，研究人员识别了HCC进展中的关键驱动因素SF3B4-TBX3+2a轴，以及乐伐替尼耐药的关键机制——GCLC介导的抗铁死亡通路。研究揭示了SF3B4通过调控选择性剪接，特别是促进TBX3+2a剪接变体的产生，在肝癌发生和发展中发挥核心作用。同时，发现乐伐替尼耐药与铁死亡逃避密切相关，靶向GCLC或诱导铁死亡能有效逆转耐药。

该研究的意义在于：首先，证实了类器官CRISPR筛选平台在发现癌症新靶点和机制方面的强大能力；其次，阐明了剪接调控异常在HCC中的重要作用，为开发靶向剪接体的疗法（如H3B-8800）提供了理论依据；第三，揭示了铁死亡在乐伐替尼耐药中的关键角色，提出了联合使用铁死亡诱导剂（如IKE、BSO）克服耐药的创新策略。这些发现为肝癌的精准治疗提供了新的视角和潜在的联合治疗策略，具有重要的临床转化价值。