细菌孢子赋能的功能可编程型细菌纤维素基工程活性材料：抗逆休眠与按需激活特性的突破

本研究针对工程活性材料（ELMs）中活细胞寿命短、环境耐受性差的问题，开发了一种基于Komagataeibacter rhaeticus和Bacillus孢子的细菌纤维素（BC）复合材料。该材料通过孢子休眠机制抵抗严苛环境，经诱导后可激活编程功能（如生物传感与催化），并实现了孢子负载效率的遗传优化和原位生物合成γ-PGA增强材料韧性，为ELMs的实际应用提供了抗逆、长效、按需激活的创新平台。

　　

自然界中的生物材料具有自主生长和复杂功能的特点，这推动了以活微生物构建的工程活性材料（Engineered Living Materials, ELMs）的发展。这类材料中的活细胞既能产生自组装构建分子形成机械强度高的基质，又能赋予材料可编程功能，如感应-响应、生物催化等。然而，细胞的“活性”也带来了挑战：短寿命限制了材料使用时间，除非持续提供营养；细胞对环境严苛条件的敏感性排除了材料的热处理或干燥等后处理选项，需要冷链物流进行全球分发，这使得它们难以在受控实验室环境之外进行现场和按需应用。因此，开发生物生长的ELMs的一个重要目标是创造具有长寿命和抗性功能的材料，以满足实际应用的需求。

为了解决上述问题，研究人员在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上发表了一项研究，他们开发了由Komagataeibacter rhaeticus和Bacillus孢子混合物在工程培养基条件下生长的材料，具有可编程、抗性和休眠功能。K. rhaeticus产生细菌纤维素（BC）基质，将Bacillus孢子整合其中，而受限的孢子保持休眠状态并对环境中的严苛条件具有抗性。Bacillus孢子可以在生长允许条件下萌发并赋予材料所需的功能。通过遗传工程调节孢子与BC基质的结合亲和力，可以提高细胞负载量，从而增强材料功能。这些材料可以作为一个多功能的按需平台，应用于生物传感器、生物催化材料和机械强度高的纤维素基复合材料的原位转化。

研究人员运用了几项关键技术：使用工程培养基（如低pH和添加Nycodenz）优化培养条件以促进孢子整合并保持休眠；通过遗传改造（如展示纤维素结合模块CBM和删除cgeA基因）增强孢子与BC基质的结合效率；采用荧光成像（如共聚焦显微镜）和扫描电镜表征材料中孢子的分布和萌发；利用诱导表达系统（如IPTG诱导的P_spac-hy启动子和甘露糖诱导的P_man启动子）实现可编程功能；并通过流变学测试和拉伸试验评估材料机械性能。孢子来自Bacillus subtilis和Bacillus paralicheniformis的标准菌株。

Engineering culture conditions to grow BC-spore living materials

通过优化培养基组成（如pH 4.0和40% Nycodenz），研究人员建立了培养条件，使孢子保持休眠、漂浮并被整合到BC基质中，同时K. rhaeticus仍能形成 robust 的BC浮膜。改性培养基虽然降低了纤维素产量，但材料仍保持物理耐久性。表征显示，K. rhaeticus细胞在数量上占主导，而Bacillus孢子主要分布在浮膜的外层20μm内。扫描电镜证实孢子被纤维素纤维封装。在生长允许条件下， encapsulated 孢子能够萌发和繁殖，24小时后CFU数量显著增加。

BC-spore living materials exhibit programmable, resistant, and dormant functionality

研究人员通过整合带有诱导型GFP表达的孢子，赋予浮膜感应-响应功能。使用B. subtilis NS1（IPTG诱导）和B. paralicheniformis GFP_ind（甘露糖诱导）孢子，在萌发后添加诱导剂，浮膜显示出清晰的GFP信号。共聚焦成像显示Bacillus细胞在浮膜内表达GFP。材料在70%乙醇、UV-A辐射、冻干或风干处理后，功能大部分得以保持，且干燥材料在室温储存6个月后仍能萌发和检测GFP信号，证实了孢子的抗性和休眠特性。

Enzyme functionalization of the BC matrix using spores from engineered B. subtilis

利用B. subtilis的高水平蛋白质分泌系统，研究人员通过分泌β-半乳糖苷酶（β-Gal）功能化浮膜作为催化材料。工程化B. subtilis NS1分泌β-Gal（由组成型强启动子P_3P驱动），在浮膜中萌发后，添加 chromogenic 底物X-β-Gal，浮膜显示出催化活性，且延长孵育时间增加酶活性，表明BC可以通过整合酶分泌Bacillus孢子进行功能化。

Engineering the binding affinity of spores to the matrix for material functionality enhancement

为提高孢子整合效率，研究人员通过修饰孢子表层蛋白（展示CBM）和减少最外层多糖层（删除cgeA）来调节孢子与BC的结合亲和力。工程菌株B. subtilis NS3（CBM表达且cgeA删除）的整合效率显著提高至8±2.3%，且孢子形成簇状分布。 higher 孢子负载量缩短了响应时间，GFP表达和酶功能化均得到增强，证明通过改善孢子表面性质提高整合效率是增强材料功能的有效策略。

In situ transformation of BC-spore materials

利用B. paralicheniformis生产γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的能力，研究人员在BC浮膜中原位生产γ-PGA，形成BC-PGA复合材料。孢子在培养基E中萌发并利用l-谷氨酸生产γ-PGA，消耗完全后，BC基质失去弹性，但纤维素网络仍稳定。干燥的BC-PGA薄膜表现出断裂伸长率显著增加（高达30%）和韧性提高（~1 MJ/m³），而拉伸强度无显著变化，赋予材料高灵活性，适用于食品包装等应用。

研究结论表明，BC-spore材料通过单培养方法制备，整合Bacillus孢子使材料能够按需代谢激活，从而将非响应性、易储存的BC转变为具有广泛应用的功能材料。孢子的抗性和休眠特性使材料能够长期存活并抵抗严苛条件，适用于实验室环境外的实际应用。与无细胞系统或酶催化材料相比，BC-spore材料在激活后能自主生产新鲜酶，无需繁琐的酶获取过程，且储存期间功能不妥协。通过调节孢子表面性质，可以控制材料中的功能细胞数量，从而控制功能水平。BC-spore材料作为一个自主材料制造平台，具有高抗性和按需可编程功能，进一步研究可以通过引入新基因电路拓宽应用范围。