碱基编辑技术赋能原发性T细胞：FAS与TGFβR2显性负突变协同增强CAR-T抗实体瘤能力

本研究针对实体瘤免疫抑制微环境（TME）中FASL与TGF-β介导的CAR-T细胞功能障碍，通过碱基编辑（BE）技术在原发性T细胞中引入内源性FAS与TGFβR2的显性负突变（dn），显著提升CAR-T对凋亡与增殖抑制的抵抗能力。结果显示，dn突变工程化CAR-T在体外杀伤、持久性及耗竭标志物表达方面均优于传统病毒载体方法，为多重基因编辑增强实体瘤免疫疗效提供了新策略。

　　

实体肿瘤一直是癌症治疗领域的顽固堡垒，尽管嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤中取得突破性进展，但其在实体瘤中的疗效仍不尽如人意。究其原因，实体瘤微环境（TME）中弥漫的免疫抑制因子——如转化生长因子β（TGF-β）和FAS配体（FASL）——如同无形的枷锁，束缚了T细胞的活力。它们通过促凋亡和抑制增殖的双重机制，削弱CAR-T细胞的攻击能力，导致疗法失效。为了打破这一僵局，研究人员将目光投向了一种精准的基因编辑工具：碱基编辑（Base Editing, BE）。

传统上，科学家常通过病毒载体在T细胞中过表达显性负突变（dominant-negative, dn）受体（如dnTGFβR2）来阻断抑制信号，但这种方法存在内源性基因未被修饰、病毒载体容量有限等问题。美国明尼苏达大学等机构的研究团队独辟蹊径，利用碱基编辑器ABE8e，在原发性人T细胞的内源性FAS和TGFβR2基因中直接引入自然存在的点突变，从而在原位将正常受体“改造”为显性负突变形式。这一策略不仅避免了双链DNA断裂（DSB）的风险，更实现了高效、精准的多重基因编辑，为CAR-T细胞“装甲化”提供了全新思路。

研究团队首先筛选了与自身免疫病或癌症相关的FAS和TGFβR2突变位点，设计了12条引导RNA（gRNA）。通过电穿孔将ABE8e mRNA与gRNA导入T细胞，7天后检测编辑效率，发现多个gRNA在目标碱基上实现了超过50%的A→G转换。其中，FAS Y232C和TGFβR2 V447A两种突变在功能验证中表现突出：前者使T细胞对FASL诱导的凋亡抵抗性提升约80%，并显著降低下游cleaved caspase 3（cC3）水平；后者则在TGF-β存在的连续刺激实验中，使T细胞增殖能力提高2.8倍，同时抑制SMAD2/3磷酸化达92%。

在CAR-T细胞应用中，研究团队进一步将TGFβR2 V447A编辑与B2M（β2微球蛋白）和TRAC（T细胞受体α恒定区）敲除相结合，构建了多重编辑的CD19 CAR-T细胞。在含有TGF-β的系列杀伤实验中，这些细胞展现出更强的肿瘤细胞清除能力和更低的耗竭标志物（LAG-3、TIM-3）表达。尤为重要的是，与慢病毒载体过表达dn受体的传统方法相比，碱基编辑的CAR-T在抗凋亡、增殖维持和杀伤效率方面均显著胜出，凸显了原位基因编辑的优越性。

关键技术方法包括：从健康 donor 外周血单核细胞中分选CD4⁺/CD8⁺ T细胞；使用ABE8e mRNA与化学修饰sgRNA通过电穿孔进行碱基编辑；通过Sanger测序与EditR软件分析编辑效率；采用FASL杀伤实验、TGF-β连续再刺激实验、CAR-T与靶细胞共培养杀伤模型等功能验证；利用流式细胞术检测细胞表型与信号分子。

Base editors efficiently install dn mutations at endogenous loci in primary human T cells

通过筛选疾病相关突变位点并设计针对性gRNA，碱基编辑系统成功在T细胞内源性FAS与TGFβR2基因中引入点突变，其中FAS Y232C、TGFβR2 V447A等位点编辑效率超过50%，为后续功能研究奠定基础。

T cells harboring dn receptor mutations installed by BE are resistant to suppression by FASL and TGF-β

功能实验表明，FAS Y232C突变细胞在FASL刺激下凋亡率显著降低，cleaved caspase 3水平下降75%；TGFβR2 V447A突变细胞在TGF-β环境中增殖能力提升2.8倍，且SMAD2/3磷酸化被有效抑制，证实dn突变可拮抗抑制信号。

Dominant-negative TGFβR2 CAR-T cells demonstrate enhanced cytolytic function in the presence of TGF-β

在TGF-β存在的条件下，携带TGFβR2 V447A的CD19 CAR-T细胞在连续杀伤实验中表现优于对照组，且耗竭标志物LAG-3、TIM-3表达降低，说明dn编辑能提升CAR-T在免疫抑制环境中的持久性与战斗力。

BE-engineered dnFAS and dnTGFBR2 CAR T cells outperform lentiviral cDNA-engineered counterparts

与慢病毒过表达dn受体的CAR-T相比，碱基编辑的dnFAS与dnTGFβR2 CAR-T在抗凋亡、增殖维持与靶细胞杀伤方面均具优势，凸显原位编辑技术避免内源性信号干扰、提升编辑纯度的价值。

研究团队在讨论中指出，碱基编辑介导的显性负突变策略兼具多重优势：它不仅避免了病毒载体的容量限制与随机整合风险，还克服了传统敲除（KO）可能引发的异构体偏移问题。此外，dn突变能“扣押”配体，保护周围未编辑细胞，这一特性在编辑效率未达100%时尤为重要。尽管dn突变可能关联某些疾病表型（如FAS T28A在自身免疫病中已知），但研究人员强调，通过精准控制突变位点与表达水平，并结合现有安全策略（如自杀开关），此类风险可控。

综上所述，这项研究首次将碱基编辑技术应用于T细胞显性负突变工程化，为实体瘤免疫治疗提供了可多重编辑、精准调控的“装甲”CAR-T平台。该策略不仅显著增强T细胞对免疫抑制信号的抵抗能力，更展现出优于传统病毒方法的疗效与安全性潜力，为突破实体瘤治疗瓶颈开辟了新的基因编辑免疫工程路径。