Ibudilast（伊布替拉斯特）通过调节免疫反应与保护微血管功能减轻脑卒中后炎症及再灌注损伤的机制研究

本研究针对缺血性脑卒中再通治疗后存在的"无效再通"现象，探讨PDE3/4抑制剂Ibudilast对微血管功能障碍和中性粒细胞介导的炎症损伤的调控作用。研究发现Ibudilast能显著改善脑灌注、减少中性粒细胞黏附与毛细血管阻塞，并使梗死体积减少>50%，为急性缺血性卒中提供了新的辅助治疗策略。

　　

脑卒中作为成人致残和致死的主要原因，当前临床采用的溶栓或机械取栓等再通治疗仅对部分患者有效。尽管这些治疗能成功开通闭塞的大血管，但并不能总是实现有效的组织灌注和良好预后，这种现象被称为"无效再通"（futile recanalization）。再灌注损伤 characterized by inflammation, oxidative stress, and microvascular failure，可能进一步加剧缺血损伤并导致无效再通。中风后微血管功能障碍的一个主要贡献者是外周炎症反应，包括可能导致微血管阻塞的中性粒细胞黏附。中性粒细胞虽然对免疫防御至关重要，但可能通过阻塞毛细血管、释放促炎细胞因子和诱导内皮功能障碍而加重缺血损伤。解决这些机制需要不仅促进血管恢复而且减轻炎症的神经保护策略。

一种新兴的治疗方法涉及靶向环核苷酸磷酸二酯酶（PDEs），这是一族调节与血管功能和免疫反应相关的细胞内信号传导的酶。PDE3和PDE4已被涉及调节血管张力、炎症和中性粒细胞活性，使其成为急性卒中干预和有希望调节无效再通的药物。Ibudilast，一种非选择性PDE3/4抑制剂，在各种神经性和炎症性疾病中已证明具有血管舒张、抗炎和神经保护特性。通过增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，Ibudilast被认为通过血管舒张增强脑灌注，这可能支持侧支循环。它还调节中性粒细胞黏附以减少毛细血管停滞，并抑制炎症细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β），同时促进抗炎介质。

虽然Ibudilast在亚洲部分地区被批准用于治疗慢性脑血管疾病，如中风后头晕和二级卒中预防，但其临床应用仅限于卒中恢复的亚急性至慢性期。在这些背景下，Ibudilast已被证明改善眩晕等症状并增强脑血流，但尚未在临床作为急性期干预进行测试。其在缺血性卒中急性期的作用，特别是在靶向早期微血管衰竭和中性粒细胞介导的损伤方面，在人类研究中仍未探索。临床前工作提供了令人鼓舞的证据：在大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型中，再灌注2小时内给予Ibudilast减少了梗死体积、脑水肿和炎症标志物表达。这些发现表明，PDE抑制可能通过改善微血管灌注和抑制炎症在急性卒中中提供双重益处。

本研究旨在探讨Ibudilast是否通过改善侧支循环和减少毛细血管内的中性粒细胞停滞来增强脑血流并减轻缺血性卒中后的微血管功能障碍。利用MCAO临床前小鼠模型，我们通过激光散斑对比成像（LSCI）和双光子激光扫描显微镜（TPLSM）评估了Ibudilast给药后的脑灌注动力学，以测量血管直径、血流速度和血管体积分数。我们进一步评估了中性粒细胞行为，重点关注使用体内成像技术的中性粒细胞黏附和毛细血管停滞。我们还研究了24小时再灌注后（24hPR）梗死体积的减少作为神经保护的指标。此外，我们探讨了治疗反应中的年龄和性别差异，考虑了不同人口群体之间血管和炎症的差异。

主要技术方法包括：使用C57BL/6小鼠（按性别和年龄分层：年轻4-6个月，年老18-20个月）建立 transient MCAO模型；Ibudilast（30 mg/kg）在闭塞后30分钟和6小时腹腔注射；通过LSCI和TPLSM进行在体成像评估血流参数和中性粒细胞行为；使用Frangi滤波图像栈进行血管体积分数（VVF）分析；通过TTC染色评估梗死体积；采用线性混合效应模型（LMM）进行统计分析。

3.1. Ibudilast在缺血性卒中后保护血管结构和功能

TPLSM能够对脑血管系统和微循环血流进行高分辨率定量分析。使用这种方法，我们测量了皮质区域的血管直径、血流速度和红细胞（RBC）通量。LMMs揭示了时间对卒中后血管直径的显著主效应（p < 0.001），再灌注后3小时和24小时出现明显的血管收缩。在3小时（p = 0.001）和24小时（p = 0.006）的显著治疗×时间相互作用表明，与未治疗（Vehicle）对照组相比，Ibudilast治疗减轻了卒中诱导的血管狭窄。在年轻小鼠中，Ibudilast在3小时（+5.18 μm, p = 0.007）和24小时（+4.28 μm, p = 0.038）显著减少了血管收缩。在年老小鼠中，在3小时（+4.81 μm, p = 0.020）和24小时（+5.03 μm, p = 0.024）观察到类似的保护作用。

3.1.2. 血流速度

线性混合效应模型揭示了时间对血流速度的强劲主效应（p < 0.001），在所有动物中再灌注后3小时和24小时观察到显著降低，表明卒中对脑灌注的一致影响。分层分析表明，Ibudilast治疗以队列特异性方式调节这种下降。在年轻小鼠中，Ibudilast在24hPR显著减弱了血流速度的减少（+3.25 μm/s, p = 0.019），并在3hPR显示出保护趋势（+2.25 μm/s, p = 0.073）。在年老小鼠中，在3hPR观察到保护趋势（+1.91 μm/s, p = 0.056），尽管在24hPR未见显著效应（p = 0.203）。性别分层模型揭示了在雌性中的显著效应，其中Ibudilast在3hPR（+2.74 μm/s, p = 0.010）和24hPR（+3.98 μm/s, p = 0.001）显著减轻了血流速度的下降。相比之下，雄性在任一时间点未表现出显著治疗效应（p > 0.1）。

3.1.3. RBC通量

RBC通量是组织水平灌注的一个指标，反映了血管直径和速度，在卒中后显著降低，并且这种下降被Ibudilast减轻。线性混合效应模型在3hPR（p = 0.005）和24hPR（p = 0.006）识别出显著的时间×治疗相互作用，表明Ibudilast在侧支和表面血管中更好地保留了RBC通量。在年轻小鼠中，Ibudilast在3hPR（p = 0.012）和24hPR（p = 0.024）减弱了减少。在年老小鼠中，在24hPR观察到显著效应（p = 0.044），在3hPR有非显著趋势（p = 0.137）。雄性在3hPR显示出接近显著的差异（p = 0.052），在24hPR无效应（p = 0.253）。雌性在3hPR（p = 0.034）和24hPR（p = 0.002）均表现出保护，中位值在24hPR接近基线。

3.2. Ibudilast在表面和毛细血管网络中保护血管体积分数

血管体积分数（VVF）的定量分析提供了给定区域中灌注的脑微循环量的度量。VVF分析显示缺血性卒中诱导了显著的微血管损害，在毛细血管VVF中观察到最显著的减少。LMMs在3hPR（p = 0.003）和24hPR（p = 0.007）识别出显著的时间×治疗相互作用，表明Ibudilast治疗减轻了随时间推移的血管完整性损失。在所有时间点和组中，VVF值在毛细血管层持续低于表面层（p < 0.001），反映了微循环对缺血损伤的更大脆弱性。在毛细血管隔室3小时，Vehicle治疗小鼠表现出VVF的显著下降（-16.54%），而Ibudilast治疗动物表现出 modest increase（+2.17%），显著治疗效应（p < 0.0001）。

3.3. Ibudilast以时间和治疗依赖性方式减少卒中后中性粒细胞积累

TPLSM能够在卒中后随时间推移可视化毛细血管床中中性粒细胞的动态运动，包括阻塞微循环的“停滞”。为了评估卒中后中性粒细胞积累的动态和Ibudilast的调节效应，我们拟合了一系列以小鼠ID作为随机截距的线性混合效应模型（LMMs）来解释重复测量。模型包括时间点、治疗、年龄、性别及其交互项的固定效应，而队列中位基线中性粒细胞计数作为协变量包含以校正初始队列间变异性。在所有动物中，我们观察到时间的显著主效应，表明卒中后循环中性粒细胞 robust increase（p < 0.001）。中性粒细胞计数在3hPR急剧上升，并在24hPR保持升高。还检测到治疗的主效应，Ibudilast治疗动物表现出显著低于Vehicle的中性粒细胞计数（p < 0.001）。

3.5. 中性粒细胞积累与血管测量受损相关

我们通过将中性粒细胞log? fold change（log?FC）与三个关键血管测量指标：血管直径、血流速度和RBC通量相关联，检查了卒中诱导的中性粒细胞积累与血管功能障碍之间的关系。在所有动物中，中性粒细胞log?FC与血管直径（ρ = -0.328, p = 0.0049）、速度（ρ = -0.290, p = 0.0136）和RBC通量（ρ = -0.441, p = 0.0001）显示出显著的负相关。这些关联在24小时时间点更强。具体地，在24hPR，血管直径（ρ = -0.577, p = 0.0013）、血流速度（ρ = -0.417, p = 0.0272）和RBC通量（ρ = -0.645, p = 0.0002）均显示出与中性粒细胞积累的强劲负相关。

3.7. Ibudilast跨年龄和性别减少梗死体积

Ibudilast治疗导致所有人口群体中梗死体积的显著且一致减少，包括年轻和年老动物以及雄性和雌性。在年轻队列中，平均梗死体积从Vehicle治疗动物的约49%减少到Ibudilast治疗动物的19%（p = 0.0002）。在年老队列中，梗死体积从约47%减少到16%（p = 0.0002）。按性别分层，Ibudilast将雄性梗死体积从约50%减少到22%（p = 0.0003），雌性从47%减少到14%（p = 0.0004）。

研究结论与讨论表明，PDE3/4抑制与Ibudilast改善了卒中后的血管功能，增强了微循环灌注并减少了脑损伤。尽管LSCI测量的区域血流没有显著变化，但我们观察到特定血管测量指标的强劲益处：软脑膜小动脉保持扩张，RBC流速更高，并且治疗动物毛细血管中RBC通量增加。这些效应在年龄和性别组中均明显，突出了即使倾向于更差结局的队列（年老和雄性受试者）也能实现改善的血管灌注。重要的是，治疗动物在表面和毛细血管隔室中保持了更高的血管体积分数（VVF），表明微血管网络的保存。这种持续灌注伴随着中性粒细胞积累和毛细血管停滞的抑制，并最终转化为更小的梗死体积。这些结果表明，靶向微循环——通过保存血管血流动力学和预防中性粒细胞诱导的血流阻塞——可以改善大血管再通后的卒中结局。

从机制上讲，限制中性粒细胞参与的益处是双重的：它防止毛细血管的物理阻塞，并可能减少来自中性粒细胞衍生酶和氧化物质的继发性炎症损伤。我们的发现与其他临床前研究的证据相似，其中中性粒细胞耗竭（例如，通过抗Ly6G抗体）恢复了微血管血流并导致更小的梗死，而不增加出血风险。这些数据加强了前提，即中性粒细胞堵塞微血管是卒中早期灌注缺陷的一个主要可逆贡献者，并且靶向这一过程可以 dramatically improve microcirculatory perfusion。

Ibudilast的抗炎特性已在其他模型中得到证明，包括过敏性炎症和神经炎症性疾病。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）（多发性硬化模型）中，Ibudilast降低了疾病严重程度、炎症浸润，并抑制了T细胞和巨噬细胞的细胞因子释放。其对嗜酸性粒细胞上β2整合素表达（CD11a, CD11b, and CD18）的抑制和对炎症介质如血小板活化因子（PAF）和白三烯D4（LTD4）的拮抗进一步支持其在blunting neutrophil-endothelial interactions中的作用。此外，Ibudilast已被证明抑制Toll样受体4（TLR4）和巨噬细胞迁移抑制因子（MIF），两者都是神经炎症的关键激活剂。从机制上讲，这些效应可能由优先抑制PDE4A和4B（在促炎白细胞中上调的亚型）驱动。Ibudilast还减少缺血脑中的促炎细胞因子并增强抗炎和神经营养信号。

除了免疫调节，Ibudilast通过提升cAMP和cGMP、刺激一氧化氮（NO）和前列环素释放以及抑制血小板聚集来增强血管舒张。它通过抑制ADP-和PAF诱导的聚集和降低关键标志物如血小板因子4和β-血栓球蛋白来抑制血小板活化。这些多模式效应，作用于免疫细胞、内皮、平滑肌和血小板，汇聚以保护微血管，并可能减轻血栓形成风险，这是微血管衰竭的一个已知贡献者。

保护的血管功能在宏观和微血管水平上转化为有意义的神经保护。治疗动物 consistently showed smaller infarct volumes compared to controls，强调改善的灌注拯救了处于风险中的脑组织。重要的是，Ibudilast的首次剂量在卒中发作后30分钟给予，再通之前，表明早期干预在闭塞期间保存了侧支和毛细血管灌注。通过维持毛细血管血流，治疗可能延长半暗带存活并限制梗死扩展，直到再通建立。这些发现支持新兴观点，即成功的卒中治疗不仅需要重新开通闭塞动脉，还要确保血液到达发生氧交换的毛细血管床。

临床证据支持Ibudilast的血管舒张和抗炎效应，尽管在人类卒中中的使用主要限于亚急性和慢性期。在日本和韩国，Ibudilast长期被批准用于慢性脑血管疾病，如卒中后头晕和与脑缺血相关的症状。一项正电子发射断层扫描（PET）成像研究表明，单次口服Ibudilast剂量在30分钟内导致脑血流快速增加；然而，这是在慢性卒中后阶段进行的，而非急性卒中发作时。在一项大型多中心开放标签试验（>900患者）中，在亚急性阶段（卒中后数天至数周）给予Ibudilast与良好耐受性和两年内低年复发率相关，尽管未建立明确的复发减少。

由于许多患者延迟到达，一个可行的临床切入点是再通（溶栓或血栓切除术）时给予静脉制剂。制剂应无乙醇，与造影剂和血管内设备兼容，并准备在超急性工作流程中使用。剂量选择应受人类药代动力学和药效学指导，参考此处观察到的有效暴露窗口。安全优先事项包括稳定的血压、不增加出血转化以及不干扰标准溶栓或血栓切除术程序。一个分阶段的路径，从急性缺血性卒中的药代动力学和安全研究开始，随后在再通时进行辅助试验，终点如CT或MR灌注指数的微血管血流、血管造影残留低灌注、早期梗死生长和90天功能结局，提供了清晰的转化路线。按年龄、性别、血管风险和侧支状态分层将进一步支持普适性。

虽然口服生物利用度支持在亚急性或维持背景中的持续使用，但急性设置可能需要与再通一致的静脉途径。总之，临床前数据突出了Ibudilast在急性给予时保护微循环的能力，表明其 combined vasodilatory, anti-inflammatory, and anti-thrombotic actions 可能增强缺血后关键早期小时的再灌注质量，并补充机械或药理学再通方法。