综述：蛋白质组学技术进展中癌症研究的不断演进的分层和生物标志物发现

本综述系统回顾了蛋白质组学技术35年来的发展历程及其在癌症研究中的关键作用。文章详细介绍了从二维电泳(2DE)到现代质谱(MS)技术的演进，重点阐述了软电离技术如MALDI和ESI的原理与应用，深入分析了定量蛋白质组学策略包括SILAC、iTRAQ和TMT等标记技术的优势。作者特别强调了蛋白质组学在发现癌症生物标志物、解析肿瘤异质性、指导免疫治疗以及推动液体活检等领域的重要贡献，展现了多组学整合在实现精准医疗中的巨大潜力。

　　

引言

蛋白质组学这一概念由Mark Wilkins于1994年提出，旨在系统研究生物体在特定状态和时间点的全部蛋白质组成。这一领域从最初基于二维电泳(2DE)的蛋白质分离技术，历经35年发展，已成长为能够解析蛋白质相互作用、修饰、定量和定位的成熟学科。技术的进步为增强生物标志物发现和推动个性化医疗奠定了坚实基础，特别是在应对癌症等复杂疾病方面展现出巨大潜力。

早期发展——前稳定同位素标记时代

蛋白质定量最初依赖于2D-PAGE结合光密度分析技术，通过比较处理组与对照组的蛋白质表达差异来理解生物学功能。然而，2DE-PAGE方法存在明显局限性：难以检测膜结合蛋白、低丰度蛋白以及极端等电点(pI)的蛋白质。随着质谱技术发展，特别是与液相色谱(LC)联用的非凝胶分离策略，成功克服了这些技术瓶颈，推动了蛋白质组学研究范式的转变。

电离方法的革新

电离过程是质谱分析的核心环节，将中性分子转化为带电离子。电离技术可分为软电离和硬电离两大类。软电离技术如电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)能够产生最小碎片化的离子，保持分子结构完整性；而硬电离方法如电子轰击电离(EI)则会产生显著碎片，提供详细结构信息。

MALDI技术诞生于1988年，通过将分析物与特定有机基质（如α-氰基-4-羟基肉桂酸、芥子酸等）共结晶，在激光照射下实现生物大分子的温和电离。该技术具有自动化程度高、灵敏度高（飞克级别）和耐受样品异质性等优势，但也存在无法与LC在线联用、重复性较差等局限性。

ESI技术由Fenn等人开发，通过施加高压电场使液体样品形成泰勒锥并分散成带电液滴，最终产生多电荷离子。与MALDI相比，ESI的最大优势在于能够与高效液相色谱(HPLC)在线联用，实现复杂生物样品的自动化分析。

基于质谱的定量蛋白质组学

在药物发现应用中，测量蛋白质相对丰度的变化至关重要。基于质谱的"鸟枪法"蛋白质组学采用类似基因组学的策略：将蛋白质混合物酶解成肽段，通过高效液相色谱分离后进入质谱分析。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术结合数据依赖采集(DDA)或数据非依赖采集(DIA)模式，实现了复杂蛋白质混合物的高通量分析。

定量蛋白质组学主要分为稳定同位素标记和无标记两种策略。稳定同位素标记又可细分为代谢标记和化学标记，其中代谢标记的优势在于在实验早期就引入标记，最大限度减少样品制备过程中的变异。

标记技术的精进

同位素编码亲和标签(ICAT)是首个化学标记定量方法，通过标记半胱氨酸残基实现样品间差异比较。然而该方法存在偏向性，无法检测不含半胱氨酸的蛋白质（约占总数10%）。

串联质量标签(TMT)和iTRAQ等同量异位标记技术的出现解决了这一问题。这些标记在MS2水平进行定量，具有更好的信噪比和准确性。TMT-6plex等多元标记试剂能够同时分析多个样品，大大提高了实验通量。

稳定同位素氨基酸细胞培养(SILAC)技术通过将稳定同位素掺入氨基酸，在细胞生长过程中实现蛋白质代谢标记。经过5-7代细胞倍增后，标记效率可达95%以上，为蛋白质定量提供了高度准确的解决方案。

蛋白质组学在癌症研究中的核心作用

癌症患者生物样本的蛋白质组学研究旨在识别具有高敏感性和特异性的生物标志物，揭示疾病状态的重要信息。虽然许多癌症类型已基于基因组和转录组特征进行分类，但RNA与蛋白质产物之间的功能关系并不完全一致。蛋白质组特征反映了细胞的功能状态，在识别相关生物标志物和设计靶向分子疗法方面具有独特价值。

解析癌症进展相关生物学过程

转移是癌症的关键特征，也是患者死亡的主要原因。首个基于质谱的定量蛋白质组学应用是通过ICAT技术研究胰腺癌蛋白质组，发现膜联蛋白A2、组织蛋白酶B和基质金属蛋白酶等蛋白质的差异表达与肿瘤侵袭和转移密切相关。

基质金属蛋白酶(MMPs)在转移和血管生成中发挥重要作用。通过iTRAQ等技术，研究人员系统发现了MMP2和MMP9的新型底物，包括骨桥蛋白、HSP90α、半乳糖凝集素-1等，为理解蛋白酶调控网络提供了新视角。

在三阴性乳腺癌(TNBC)研究中发现，侵袭性强的细胞系上皮-间质转化(EMT)相关蛋白表达升高，而细胞增殖相关蛋白表达降低，这表明综合蛋白质组分析能够揭示恶性肿瘤细胞的分子行为特征。

发现新型生物标志物以分层异质性癌症

可靠的分子生物标志物应当像指纹一样独特，能够区分不同的生物学状态。目前广泛使用的TNM分期系统主要基于癌症的解剖学特征，但解剖学相似的癌症可能由完全不同的分子特征驱动。

蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析已被用于食管癌的亚分类，揭示不同亚型的特异性脆弱性。类似研究在肺腺癌中发现AGER、CACNA2D2、LAMP3等与正常肺生理相关的蛋白质在肿瘤组织中表达缺失。

体液蛋白质组分析为无创诊断提供了新途径。通过分析231例人类尿液样本，研究人员确定了铁蛋白轻链(FTL)、MAPK1P1L、纤维蛋白原β链(FGB)等五种生物标志物组合，不仅能诊断肺癌，还能区分肺癌与其他癌症类型。

新型癌症疗法的开发

蛋白质组学研究成功促进了分子靶点的发现。在TNBC研究中，通过对78个样本的分析鉴定出Mage-A4作为潜在治疗靶点，该蛋白不仅存在于肿瘤病变中，还能在患者间质液和血清中检测到。

对于头颈部小细胞癌(HNSCC)及其肺转移灶的蛋白质组比较研究，揭示了它们独特的表达特征，这种分子特征有助于预后分层和治疗方案制定。

肿瘤异质性对治疗反应产生重要影响。对102个石蜡包埋乳腺癌样本的蛋白质组分析发现，部分雌激素受体(ER)+/孕激素受体(PR)+肿瘤样本与三阴性病例共享表达特征，这一发现对传统亚型分类和靶向药物筛选具有重要意义。

克服化疗耐药

尽管放疗、化疗和免疫治疗不断进步，复发仍然是导致死亡的重要原因。蛋白质组学分析有助于识别获得性治疗耐药的新分子靶点。

在胰腺导管腺癌(PDAC)中，对吉西他滨耐药细胞的蛋白质组和磷酸化蛋白质组研究发现，微管相关蛋白MAP2表达上调与获得性耐药相关。有趣的是，表达MAP2的耐药细胞对Nab-紫杉醇敏感，这为联合治疗提供了新思路。

类似地，在卵巢癌研究中发现脂肪酸结合蛋白4(FABP4)是卡铂耐药的关键调节因子，其小分子抑制剂BMS309403能够显著增强癌细胞对卡铂的敏感性。

免疫治疗的关键贡献

基于免疫检查点抑制剂(ICIs)的免疫治疗，如抗CTLA4、抗PD1和抗PDL1抗体，彻底改变了癌症治疗格局。然而，原发性耐药和获得性耐药仍然是临床面临的主要挑战。

通过对116例晚期黑色素瘤患者的深度蛋白质组分析发现，应答者表现出更高的脂质代谢和氧化磷酸化水平，这种高线粒体代谢状态与更强的抗原呈递和IFN信号传导相关，增强了T细胞对癌细胞的杀伤能力。

免疫肽组学研究通过分析肿瘤细胞表面人类白细胞抗原(HLA)呈递的肽段，为CAR-T细胞疗法和个性化疫苗开发提供了重要靶点信息。

液体活检在早期检测和生物标志物发现中的应用

液体活检以其无创或微创的采样方式，在癌症早期诊断和治疗监测中展现出巨大价值。在葡萄膜黑色素瘤(UM)中，玻璃体液蛋白质组分析发现HGF、HGFR和SCFR表达升高与转移性疾病相关，为这种难以进行肿瘤活检的癌症提供了新的诊断途径。

血清蛋白质组分析通过LC-ESI-MS/MS技术，成功鉴定出聚类蛋白异构体1(CLU-1)、血小板反应蛋白1(TSP1)等胃癌血清生物标志物，展现出良好的诊断特异性。

循环肿瘤细胞(CTCs)的表型可塑性为癌症转移提供了早期指标。蛋白质组分析发现EMT相关的CTC具有更强的转移能力和化疗耐药性，ERBB2、CAVIN1和COL6A等蛋白成为早期转移的潜在生物标志物和治疗靶点。

单细胞和空间蛋白质组学的前景

单细胞蛋白质组学技术如SCoPE-MS能够在不损失蛋白质信息的情况下，实现对异质性细胞群体的精细解析。最近发展的显微镜辅助SCoPE-MS蛋白质组分析技术，能够实时监测细胞内动态过程，发现DNA损伤反应中的关键蛋白。

空间蛋白质组学进一步揭示了蛋白质功能与细胞定位的密切关系。例如，β-连环蛋白在细胞核和细胞质中发挥致癌作用，而在质膜上则表现为肿瘤抑制功能。

通过单细胞RNA测序和多重质谱流式技术，研究人员在乳腺癌中鉴定出9种不同的癌症相关成纤维细胞(CAF)亚型，每种亚型具有独特的空间分布特征。类似研究在非酒精性脂肪性肝炎肝癌(NASH-HCC)中发现髓源性抑制细胞、耗竭T细胞和肿瘤相关巨噬细胞之间的空间相互作用是免疫抑制的关键机制。

癌症蛋白质组学数据解读的挑战

尽管蛋白质组学为癌症研究提供了强大工具，但数据解读仍面临多重挑战。肿瘤异质性要求分析多个样本以提高统计功效，但这可能引入新的变异来源。样本制备过程中的不规则性，特别是单细胞蛋白质组学中的蛋白质吸附和电离效率差异，影响了数据的可重复性。

大数据分析需要复杂的统计方法和计算工具，而缺乏标准化的数据分析流程导致结果解读存在差异。此外，蛋白质组学研究通常样本量有限，统计功效不足可能产生假阳性或假阴性结果。

未来需要通过制定最佳实践指南、标准化工作流程以及开展多组学整合研究，进一步提高蛋白质组学在癌症研究中的准确性和可重复性。随着技术的不断进步，蛋白质组学必将在精准医疗时代发挥越来越重要的作用。