单细胞测序解码肾透明细胞癌伴癌栓的细胞动态与免疫微环境重塑

本研究针对肾透明细胞癌(ccRCC)伴静脉癌栓(TT)的形成机制，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术系统解析了原发肿瘤与癌栓的微环境差异。研究发现癌栓部位髓系细胞显著富集且呈现M2样极化，CD8+ T细胞表现功能耗竭特征，上皮细胞具有更强的迁移能力和基因组不稳定性。该研究为理解癌栓生态位提供了宝贵数据资源，对靶向治疗具有重要指导意义。

　　

肾细胞癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)占所有肾癌病例的70-80%。虽然早期肾癌治疗效果较好，但仍有20-30%的患者在诊断时或术后出现局部复发或远处转移，严重影响生存预后。肿瘤血栓(tumor thrombus, TT)作为肾癌的一种独特且具有侵袭性的表现，涉及肿瘤细胞侵入肾静脉、下腔静脉甚至右心房，发生率约为4-15%。TT的存在不仅使手术过程复杂化、增加风险，还显著提高了术后复发和转移的可能性，是影响ccRCC患者预后的关键因素。

传统的批量RNA测序只能提供肿瘤组织的平均基因表达谱，无法捕捉肿瘤内复杂的细胞组成和细胞间相互作用。单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术的出现使基因表达分析达到单细胞分辨率，显著增进了我们对肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)和肿瘤细胞异质性的理解。TME是一个由肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞和其他细胞类型组成的复杂生态系统，其相互作用在肿瘤生长、血管生成、免疫逃逸和转移中起着关键作用。

为了更全面地了解ccRCC伴TT的细胞和分子特征，本研究采用scRNA-seq技术对原发ccRCC和肿瘤血栓样本进行了深入分析。通过比较不同细胞类型的基因表达谱，研究人员确定了与血栓形成和进展相关的关键细胞群体、差异表达基因和调控通路，并探索了肿瘤细胞与TME中其他细胞类型之间的相互作用，以阐明它们在血栓微环境中的动态变化。

本研究通过对一名初治患者的原发肿瘤组织(PT)、癌旁正常肾组织(AN)、肾静脉肿瘤血栓组织(TT)、远端正常肾组织(DN)和肾静脉组织(RV)进行scRNA-seq分析，共分析了76,142个细胞。通过标准液滴法 protocol 处理单细胞悬液，经过质量控制和比对后得到基因-细胞表达矩阵。细胞类型根据经典标记基因的表达进行注释，识别出包括B/浆细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞和T/NK细胞在内的主要细胞群体。

研究发现T细胞在ccRCC进展中扮演重要角色。通过对T/NK细胞群体的亚群分析，揭示了四种主要细胞类型：NK细胞、增殖细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞。CD8⁺ T细胞状态在原发肿瘤和肿瘤血栓之间存在明显差异，原发肿瘤中富集表现耗竭表型(CD8_PDCD1_Tex)的CD8⁺ T细胞，而肿瘤血栓中则显示出更高比例的具有潜在记忆和组织驻留特征的CD8⁺ T细胞亚群(CD8_LEF1_Tn和CD8_IL7R_Tm)。

髓系细胞在转移过程中经历了显著重塑，形成了具有独特转录谱和功能特性的不同亚群。肿瘤血栓中表达SELENOP的TAM亚群(TAM_SELENOP)比例增加，而表达CXCL10的TAM群体较少。功能注释显示，TT髓系细胞上调了与免疫检查点和逃逸(如CSF1R、CD163)以及血管生成相关的基因，表明在TT部位具有更强的免疫抑制和促血管生成作用。

上皮细胞分析显示，原发和TT部位ccRCC组织之间存在显著的异质性和不同的转录及基因组谱。特异性上皮细胞亚群在原发肿瘤或肿瘤血栓中富集，表明在转移过程中某些肿瘤细胞状态的选择或适应。TT上皮细胞中与细胞迁移和侵袭相关的基因(MMP7、CXCL1)上调，加上粘着斑通路的富集增加，表明可能的功能特化有助于在新环境中外渗和存活。

基质细胞是肿瘤进展、转移和侵袭的关键介质。对原发肿瘤和肿瘤血栓中内皮细胞和成纤维细胞群体的比较分析揭示了不同的分子特征。TT组内皮细胞显示MARCKSL1和COL15A1表达升高，SMAD信号的正向调控在肿瘤血栓中富集，而通过MHC II类分子的抗原加工和呈递在原发肿瘤中特异性富集。

细胞间通讯网络分析揭示了肿瘤血栓与原发肾细胞癌之间不同的互作网络。肿瘤血栓中推断的相互作用数量(n=1217)高于原发肿瘤(n=826)，但平均相互作用强度相似。VWF信号在肿瘤血栓中表现出更高的通讯概率，表明在 intravasation 过程中可能有助于肿瘤细胞与内皮细胞粘附的机制。TT生态位中成纤维细胞的传出相互作用强度更强，成纤维细胞和髓系细胞之间潜在的增强的TGF-β信号表明在TT微环境中基质重塑和免疫抑制的作用。

本研究的主要技术方法包括：从一名初治ccRCC患者获取组织样本；使用MGI DNBelab C系列试剂盒构建单细胞RNA-seq文库；采用Seurat R包进行基因表达矩阵分析；使用DoubletFinder R包去除双联体；通过harmony R包去除潜在批次效应；利用Startrac R包计算Ro/e值分析组织偏好性；使用Monocle 3进行伪时间轨迹分析；应用inferCNV R包评估拷贝数变异水平。

研究结果表明，CD8⁺ T细胞景观在ccRCC进展过程中经历了显著重塑，原发肿瘤向耗竭表型转变，而肿瘤血栓中出现了不同的 naive 样群体。髓系细胞区室在TT进展过程中发生了动态适应，可能在TT生态位中培育了一个有利于TT生长和免疫逃逸的环境。上皮细胞分析显示了原发和TT部位ccRCC组织之间的显著异质性和不同的转录及基因组谱，突出了肿瘤细胞为促进在TT生态位中的传播和存活而进行的适应。细胞间相互作用分析揭示了肿瘤血栓中不同的通讯景观，其特征是可能更活跃和重新连接的网络，可能有助于转移的建立和进展。

尽管本研究仅包括一例伴有静脉肿瘤血栓的透明细胞肾细胞癌病例，需要更大队列的进一步验证，但分析仍为理解ccRCC-TT的复杂生物学以及细胞和分子特征提供了宝贵的见解并产生了重要的假设。研究人员强调了TT生态位内的几个潜在治疗靶点，这可能对预防或治疗转移性疾病具有重要意义。这些发现为未来研究奠定了重要基础，专注于这些已识别细胞群体和信号通路的功能验证的研究，理想情况下在更大的患者队列中使用体内模型，可能有助于更深入的机制理解和改进ccRCC患者的临床管理。

该研究发表在《Computational and Structural Biotechnology Journal》上，为理解肾透明细胞癌伴癌栓的形成机制提供了单细胞水平的深入见解，为开发针对癌栓微环境的靶向治疗策略提供了重要的理论依据和实验基础。