综述：靶向结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的毒力：聚焦抗感染药物设计

本综述系统探讨了针对分枝杆菌毒力因子而非传统杀菌靶点的新型抗感染策略。文章深入分析了抑制毒力（antivirulence）方法的优势，包括降低抗生素耐药性（AMR）选择压力、保护肠道微生物群，并详细评述了ESX-1分泌系统、DosRS-DosST双组分系统、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PknA/PknB/PknG）、锌金属蛋白酶-1（Zmp1）、蛋白酪氨酸磷酸酶（MptpA/MptpB）及分泌性酸性磷酸酶（SapM）等关键靶点的研究进展、挑战与未来方向，为应对结核病（TB）及非结核分枝杆菌（NTM）感染提供了创新视角。

　　

Abstract

抗菌耐药性（AMR）是目前全球人类健康面临的十大严重威胁之一，而分枝杆菌是这一威胁的关键因素之一。人们普遍认识到需要新的抗菌治疗方法；其中之一就是抑制细菌毒力。与传统以细菌生长必需功能为靶点的抗生素发现模式不同，毒力抑制方法旨在中和细菌而非消灭它们。本综述分析了细菌毒力本身研究以及开发影响其药物的可能性方面的成功、失败和前景。

Introduction

抗菌耐药性（AMR）已迅速从一个遥远的担忧演变为一个紧迫的挑战，并位列全球十大健康威胁之中。2021年，细菌耐药性估计导致471万人死亡，其中114万人死亡与AMR直接相关。结核分枝杆菌（Mtb）是AMR的主要贡献者之一。当前全球结核病（TB）管理中最令人担忧的是对最强大的一线结核病药物利福平（RR-TB）的耐药性。对另一种一线结核病药物异烟肼（INH）耐药，或对INH和利福平均耐药的结核病，分别被定义为耐异烟肼结核病（HR-TB）或耐多药结核病（MDR-TB）。这些耐药结核病例需要使用毒性更大的二线药物治疗，而对二线药物的耐药性也在逐渐发展。在全球范围内，2024年估计报告了40万例MDR/RR-TB病例。在新病例中，估计MDR/RR-TB患者比例分别为3.2%（新发病例）和16%（既往接受过结核药物治疗的患者）。

结核病药物组合看起来比其他细菌的药物更多，但大多数药物是很久以前开发的。与其他细菌一样，它们旨在靶向五种基本细胞功能之一，例如细胞壁生物合成[INH、乙胺丁醇、乙硫异烟胺（ETH）、pretomanid]、蛋白质合成（氨基糖苷类、大环内酯类）、DNA复制（环丙沙星）、DNA依赖性RNA合成（利福霉素类）或代谢途径（贝达喹啉）。要有效，这些传统抗生素必须每天服用4、6或9个月，具体取决于方案和药物敏感性。如此长时间的治疗降低了患者的依从性，并显著促进了AMR的发展。因为这些抗生素利用的是旧靶点，耐药性的发展几乎是不可避免的。因此，需要探索更多应对分枝杆菌感染的替代方案。

根据新结核病药物工作组和结核病联盟的研发管线，目前约有13种包含新研究药物的方案正在临床试验中进行评估。为结核病管理开发新的、有效且安全的药物联合方案是一个漫长且昂贵的过程，因为它需要解决众多因素。这些因素包括可能缩短治疗持续时间、详细的安全性和毒性特征、潜在的药物间相互作用、适用于特定患者群体、药物制剂开发以及药片的最终成本。

除了Mtb，非结核分枝杆菌（NTM）是另一个重要的公共卫生威胁。NTM是一组异质性分枝杆菌，包含200多种在环境中普遍存在的物种。NTM感染包括肺部疾病（特别是在患有慢性肺病或囊性纤维化的患者中）、浅表淋巴结炎、免疫功能严重低下患者的播散性疾病以及皮肤、软组织、骨骼和关节感染。NTM分为慢生长型（>7天）和快生长型（<7天）分枝杆菌。快生长分枝杆菌属于脓肿分枝杆菌复合群（MABC）、偶发分枝杆菌复合群和龟分枝杆菌，而最常见和临床重要的慢生长物种是鸟分枝杆菌复合群（MAC）、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌。

NTM感染的诊断和治疗具有挑战性，因为其非特异性的临床表现（因感染部位和所涉物种而异）以及对最常用抗菌药物的耐药模式。此外，由于缺乏认识诊断设施，NTM感染常被误诊为耐药结核病，使得管理更加困难。

抑制细菌毒力作为控制感染的方法在抗菌药物发现中是一个相对较新的概念。这一想法起源于所谓的抗生素发现黄金时代（1940年代至1960年代）早期。随后被放弃，并在1990年代末期当由传统抗生素的误用和/或过度使用引起的AMR威胁日益明显时，重新获得关注。毒力因子可以被一系列药物靶向，包括生物制剂、肽和小分子，它们抑制对细菌持久性和致病性至关重要的特定机制。因此，靶向分枝杆菌毒力因子依赖于通过作用于感染周期的非必需阶段来解除细菌武装的想法。这种方法，而不是直接杀死细菌，可能会降低抗生素耐药性的选择压力，从而在联合使用时延长抗生素的有效性。此外，因为毒力因子通常对病原体特异且在人类肠道微生物群中不存在，靶向它们可以导致更具选择性、窄谱的抗菌作用，最大限度地减少微生物群失调。

然而，细菌毒力是一个高度复杂的过程，涉及众多因素和途径。开发特异性抑制剂需要深入了解细菌发病机制和宿主-病原体相互作用。此外，调节毒力因子可能无法完全从受感染宿主中清除病原体，这可能导致持续性感染或复发。毒力靶向药物单独使用时显然效用有限，例如在急性细菌感染中，快速杀菌至关重要，但在联合使用时可以增强抗生素的疗效。

How to find molecules that affect mycobacterial virulence?

常规抗生素可以直接杀死细菌（杀菌剂）或阻止其生长（抑菌剂）；这在常规全细胞测定中有明确定义。然而，传统的体外生长抑制筛选方法对于识别抗毒力药物无效，因为大多数毒力因子不是体外细菌生长所必需的。发现此类化合物的现代方法涉及使用一套测定法来特异性抑制选定的酶体外（即基于靶点的筛选）。然而，尽管这种方法能有效识别抑制剂，但不能保证这些化合物在体内具有抗毒力活性。在这方面，离体感染模型中的测定可能更可靠。事实上，目前已开发出几种感染模型，例如在巨噬细胞中（即在小鼠骨髓来源的巨噬细胞、J774A.1巨噬细胞、THP-1巨噬细胞和人类外周血巨噬细胞中，这些模型已被证明能成功识别具有有效抗毒力活性的分子）。毫无疑问，最可靠的方法仍然是体内测定。在这方面，已经开发了更简单、更便宜的方法，使用大蜡螟或斑马鱼等，而不是涉及小鼠、兔子或非人灵长类动物的动物感染模型。最后，基于人工智能的方法最近对药物发现做出了重大贡献，彻底改变了预测生物分子特性和结构的能力，并能够生成新的活性化合物。因此，基于机器学习的建模也可以通过提供一种规避传统药物发现方法相关局限性的方式，在抗毒力药物领域做出重要贡献。

Small molecules targeting mycobacterial virulence factors: is there any progress?

尽管针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗毒力小分子已被广泛研究，但靶向分枝杆菌毒力因子的化合物仍处于药物发现的早期阶段。在本综述中，我们重点介绍了通过高通量测定发现的一些有趣的分子。我们未涵盖噬菌体、疫苗或脂质体作为抗毒力方法。

Type VII secretion ESX-1 inhibitors

ESX VII型分泌系统是致病性分枝杆菌物种中的主要毒力因子。在Mtb中，ESX-1、ESX-3和ESX-5是毒力的关键组成部分，而关于ESX-2和ESX-4在Mtb驱动的感染中的作用知之甚少。此外，ESX-1负责分泌最重要的Mtb抗原：ESAT-6（EsxA）和CFP-10（EsxB）。通过这种方式，ESX-1促进吞噬体逃逸和宿主细胞裂解，同时抑制宿主细胞防御机制。这对于细菌在宿主免疫细胞中的生存至关重要。

迄今为止，只有少数已知的化学化合物能抑制VII型分泌机制。ESX/VII型分泌受至少一个双组分调控系统调节，第一个是PhoPR。为了识别可能靶向PhoPR调节子的药物，Johnson等人使用酸性pH诱导的PhoPR依赖性荧光报告基因，对包含220,000个化合物的库进行了全细胞高通量筛选（HTS）。他们发现了乙氧唑胺，这是一种磺胺类碳酸酐酶抑制剂，用于治疗青光眼以及作为利尿剂。乙氧唑胺在受感染的小鼠骨髓来源巨噬细胞中抑制了90%的Mtb PhoPR依赖性绿色荧光蛋白（GFP）报告细胞，并在巨噬细胞和受感染小鼠中减少了Mtb的生长。

另一个调节ESX-1的双组分系统是MprAB。Rybniker等人发现了两个先导分子：BTP15，一种先前被描述为蛋白激酶G（PknG）抑制剂的苯并噻吩基分子，和BBH7，源自基于肺成纤维细胞的HTS。这两种化合物均在纳摩尔浓度下阻断了主要毒力决定因子EsxA（一种ESX-1底物）的分泌，并促进了THP-1巨噬细胞中的吞噬体成熟，从而降低了细菌负荷。靶点识别研究表明，BTP15也抑制组氨酸激酶MprB。

Jia等人开发了另一种HTS测定法，使用荧光素酶融合的CFP-10报告基因来识别抑制ESX-1分泌但不损害体外细菌生长的小分子。其中一个选中的先导化合物IMB-BZ，被发现以ESX-1依赖性方式降低毒力。最初，IMB-BZ（硝米特）是一种用于预防和治疗家禽（鸡和火鸡）球虫病的抗寄生虫药。这种化合物在动物体内的代谢已有详细记载；在大鼠中，它被迅速还原为代谢物，并且在口服或腹腔注射后1小时就检测不到大鼠血浆中的原药。这引发了在所开发测定中研究这些代谢物的问题，但论文中未涉及此点。

最近，发现了具有双重活性的乙硫异烟胺（ETH）增效剂，它们能独特地抑制ESX-1分泌系统。除了抗毒力分子外，它们还增强了像ETH这样的分枝杆菌前体药物的活性，ETH的耐药性可以通过其激活剂（EthA）的阻遏蛋白（EthR）的特异性抑制剂来逆转。这些抑制剂促进了ETH的治疗效果，而无需高剂量。使用成纤维细胞存活率和刃天青微孔板测定法筛选Specs World Diversity Set 3，得到了化合物S3，它在8.6 μM的IC₅₀值下保护人肺成纤维细胞。正如预期，S3在浓度高于50 μM时不抑制分枝杆菌生长。研究表明S3既作为ESX-1抑制剂，又作为ETH增效剂。随后的构效关系（SAR）研究使他们能够分离这些特性，并得到S3_106作为ESX-1抑制剂。尽管这些分子在预防分枝杆菌发病机制的体外和离体结果中显示出前景，但它们在动物模型中的效力仍有待确定。

有趣的是，脓肿分枝杆菌（Mab）仅拥有ESX-3和ESX-4系统，缺乏ESX-1系统，但有人提出ESX-4可以被视为ESX-1的替代物。此外，研究表明ESX-3与铁代谢有关，并在Mab的生物膜形成和细胞内生存中起重要作用。这表明了在NTM中靶向这些蛋白质和途径的潜力。在此背景下，应注意水杨酸合成酶已在Mtb和Mab中成功被靶向，导致铁载体的显著减少。

Two-component regulatory system DosRS–DosST inhibitors

DosRS/DevRS调控系统与Mtb的毒力和缺氧期间的生存有关，使其能够感知宿主免疫信号。特别是，DosS是一种传感器组氨酸激酶，DosR是一种反应调节器。这个系统由缺氧、一氧化氮和一氧化碳诱导，刺激非复制持久态。在这种状态下，细菌变得对几种抗菌药物具有耐受性体外，并被认为是抗结核治疗疗程延长的原因。

发现了六种来自不同类别的DosRST双组分调控系统抑制剂，它们对Mtb生长的影响极小。其中，抗疟药青蒿素通过靶向传感器激酶血红素，直接抑制Mtb DosS和DosT激酶。为了更深入了解其作用机制（MoA），提出其过氧化物键通过血红素进行还原活化，产生自由基，使血红素和寄生虫蛋白烷基化，表明了一种多功能的作用模式。与青蒿素类似，HC106A通过不同的机制直接靶向传感器激酶DosS的血红素。初步的SAR研究确定了化合物MSU-39446，它在亚微摩尔浓度范围内具有全细胞DosRST抑制活性。

在发现Mab中的DosRS调控系统后，Belardinelli等人评估了其他合成抗疟过氧化物对Mab DosRS系统的影响。其中，OZ439，一种青蒿素的合成下一代衍生物，靶向Mab DosS蛋白的传感器激酶血红素，成为最有趣的分子。确实，OZ439（200 mg/kg）在Mab感染的急性严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠模型中减少了肺和肝脏中的分枝杆菌负荷。而且，OZ439与标准护理抗生素联合使用增强了它们的疗效。

Serine/threonine protein kinase PknA/PknB/PknG inhibitors

丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，如酪氨酸蛋白磷酸酶，在调节分枝杆菌生理学，特别是毒力方面起着重要作用。这些激酶中的两个，PknA和PknB，已被证明是必需的。相反，PknG对于Mtb的体外生长不是必需的，但对于在巨噬细胞中的生存和动物模型中的感染是至关重要的。这些细菌酶的催化结构域与真核蛋白激酶的催化结构域同源。因此，预计分枝杆菌Ser/Thr蛋白激酶药物发现活动中的命中化合物数量将来自可用的激酶化学库，这些库共享酶结合所需的共同结构特征。然而，这些相似性引发了对潜在脱靶毒性的担忧。

PknB是第一个被研究其治疗潜力的Mtb Ser/Thr蛋白激酶。小分子靶向PknB的可能性在Drews等人的开创性工作中被描述，其中化合物H7在微摩尔浓度下对Mtb PknB以及牛分枝杆菌卡介苗（BCG）和耻垢分枝杆菌的生长均有活性。然而，尽管已经鉴定出几种具有抗分枝杆菌活性的PknA和PknB抑制剂，包括天然产物（NP）如K252a，但它们大多数对哺乳动物激酶的选择性较差，导致细胞毒性效应。

尽管如此，在2004年，Walburger等人发现另一个Mtb Ser/Thr蛋白激酶PknG通过抑制吞噬体-溶酶体融合在巨噬细胞内的分枝杆菌生存中起作用。他们从Axxima Pharmaceuticals化学库中鉴定出AX20017；这种小分子选择性抑制PknG活性，对其他分枝杆菌Ser/Thr激酶以及人类激酶没有影响。然而，这种先导化合物显示出开发缺陷，如代谢稳定性差、脱靶活性和专利性差，需要进一步微调。药物化学优化周期导致鉴定出一些具有改进PknG抑制作用的先导化合物，并进一步优化。此外，发现该分子能在不显示THP-1毒性的情况下，适度减少巨噬细胞中的Mtb菌落形成单位（CFU）。

其他作用于PknG的分子包括R406、NU-6027、RO9021和L2W。

Zinc metalloprotease-1 inhibitors

分枝杆菌锌金属蛋白酶-1（Zmp1）是Mtb细胞内生存和致病性的必需酶，但其功能仍不清楚。近年来，为开发靶向分枝杆菌锌金属肽酶Zmp1的分子做出了重大努力。通常，所有锌金属蛋白酶抑制剂的设计都意味着使用所谓的锌结合基团来螯合活性位点内的催化Zn²⁺，包括硫醇盐（S^?）、羧酸盐（COO^?）和异羟肟酸（HONH-CO）。

评估Mtb Zmp1抑制潜力的开创性工作由Botta小组完成，他们通过结合计算机结构分析和生化评估，鉴定了弱抑制剂ZTB12。第二轮虚拟筛选导致选择了ZTB23，显示K_i在纳摩尔浓度范围内，其中ZTB23（S）对映体在THP-1感染的巨噬细胞中抑制Mtb生长，而R-对映体出乎意料地没有显示离体活性。

进一步的研究通过杂交众所周知的锌结合部分进行，例如羟基喹啉和异羟肟酸，噻唑烷二酮和异羟肟酸，但所有化合物仅表现出适度的离体抗Mtb活性。这些发现引发了对Zmp1的可成药性及其治疗应用潜力的质疑。

Protein tyrosine phosphatase MptpA/MptpB inhibitors

两种MptpA和MptpB酪氨酸磷酸酶在Mtb毒力中的作用于2000年首次揭示。它们是由Mtb分泌到巨噬细胞细胞质中的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），是宿主内生存和感染所必需的。由于PTP介导的信号事件对细胞寿命至关重要，开发这些酶的抑制剂受到了显著关注。酪氨酰磷酸（pTyr）残基是PTP配体识别的关键组成部分。因此，开发含有不可水解的pTyr模拟物的小分子是设计特异性抑制剂的常用方法。通常，大多数人类酪氨酸磷酸酶抑制剂含有此类pTyr模拟物，如二氟甲基膦酰苯丙氨酸（F₂Pmp）、水杨酸或磺胺酸，以改善靶点结合。这种结构方法也被用于分枝杆菌PTP的抑制剂。

小分子靶向MptpA和MptpB的可能性在五年后由Waldmann及其同事报道，他们采用了各种NP核心结构来鉴定酪氨酸磷酸酶抑制剂。

第一个证明分枝杆菌酶MptpB是可成药靶点的证据来自Zhou及其同事的工作，他们评估了一个能够与该酶的活性和外周位点相互作用的苯并呋喃水杨酸基化合物库，并鉴定了第一个强效抑制剂I-A09（IC₅₀ 1.26 μM）。尽管它在感染的J774A.1巨噬细胞中具有高活性并且对酶有强效，但其针对一组人类PTP的选择性（约10倍）相对一般，需要进一步优化。因此，通过在第3位引入体积较小的取代基，对母体苯基苯并呋喃-5-羧酸核心1进行了修饰，得到了化合物L01-Z08。该化合物对MptpB显示出纳摩尔水平的效力，对人类PTP的选择性有所改善，并在Mtb感染的J774A.1巨噬细胞模型中表现出良好的疗效。然而，该化合物在慢性结核感染豚鼠模型中无活性，可能是由于生物利用度不足。

接下来，Zhang及其同事发现头孢磺啶，一种对铜绿假单胞菌有活性的第三代窄谱头孢菌素抗生素，是对该酶具有弱抑制活性的先导化合物（IC₅₀ 16 μM）。由于其庞大的结构和化学不稳定性，研究人员将其分为三个结构部分以识别MptpB药效团。只有α-磺基苯乙酸酰胺（SPAA）片段表现出活性（IC₅₀ 180 μM）；另外两个片段未显示任何MptpB抑制。在对接数据的指导下，酰胺修饰产生了高选择性的竞争性MptpB抑制剂cpd9，其对MptpB的IC₅₀在纳摩尔范围。奇怪的是，SPAA的进一步基于片段的优化导致了MptpA竞争性抑制剂L335-M34的发现，其对MptpA的IC₅₀为0.16 μM，对MptpB的IC₅₀超过32.0 μM。L335-M34降低了Mtb感染巨噬细胞中的细菌负荷，但在豚鼠慢性结核感染模型中的治疗价值尚不清楚，因为肺CFU减少有限。

最近，基于先前报道作为靶向哺乳动物PTP的不可水解磷酸酪氨酸（pTyr）模拟物的支架，Ruddraraju及其同事认识到草酰氨酸是生成和筛选改进的MptpB抑制剂的一个良好起点，鉴定了含苯乙炔基的化合物，这些化合物对酶表现出亚微摩尔效力，并且对哺乳动物酶的选择性高出4500倍以上。然而，尚未报道离体活性。

使用类似的方法，Beresford等人从最初针对人类酪氨酸磷酸酶开发的聚焦分子库中鉴定了C1。该分子是一种适度的MptpB抑制剂，具有降低J774A.1巨噬细胞中分枝杆菌负荷的能力。进一步的分子对接和合理的先导化合物优化导致了C13的鉴定，该化合物在J774A.1巨噬细胞感染模型中对MptpB和Mtb显示出高活性。此外，在急性和慢性豚鼠结核感染模型中作为单一疗法的评估显示，用C13治疗能够减少肺中的细菌负荷。有趣的是，最近证明C13治疗对NTM鸟分枝杆菌有效，可降低RAW264.7巨噬细胞中的细胞内负荷，并在大蜡螟感染模型中增加贝达喹啉和利福平的疗效。

此外，使用计算机方法已成功鉴定了新的MptpB抑制剂。例如，Zhang等人通过基于结构的虚拟筛选，鉴定了化合物15，该化合物对酶有活性，并能在感染的J774A.1巨噬细胞中减少细胞内分枝杆菌生长。对该化合物的SAR研究提供了优化的化合物13，其效力提高了20倍。

Secretory acid phosphatase SapM inhibitors

分泌的磷酸酶SapM使磷脂酰肌醇-3-磷酸去磷酸化，这是一种在吞噬体成熟中起重要作用调节脂质。因此，它对Mtb的致病性至关重要。迄今为止，只有少数文章关注SapM抑制剂的发现和开发，这表明了该靶点的可成药性和临床重要性。其中，Fernández?Soto等人鉴定了tyrphostin AG183及其异构体（最初开发作为表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂）作为良好的SapM抑制剂，能够抑制THP-1巨噬细胞中的Mtb负荷。然而，tyrphostin家族已获专利的事实使得进一步开发困难。

Concluding remarks and future challenges

抗毒力方法与传统的抗生素发现模式相反：尽管现有药物靶向细菌生长的必需功能，抗毒力化合物影响细菌的非必需功能。该策略旨在解除细菌武装而非杀死它们，并降低其致病性。这种方法可能避免或最小化抗生素耐药性的发展，因为预测的选择压力弱于杀菌或抑菌化合物。此外，根据其毒力靶点及其在物种间的保守程度，抗毒力化合物有可能具有物种特异性，从而防止对共生细菌的抑制。然而，抗毒力化合物不杀死病原体的事实可能因此无法清除感染，从而影响其临床应用。尽管如此，将抗生素与抗毒力化合物联合使用可以产生协同效应，并已被证明在治疗感染和限制抗生素耐药性传播方面可能有效。此外，与抗生素相比，抗毒力药物的开发可能更费力，成本也显著更高。目前也没有或很少有标准化的、高通量的测定法可用于评估抗毒力化合物。这一缺点减缓了早期药物发现和开发的进程，并使其更加困难。2013年，Lewis指出：“15-20年前，几家大型制药公司设立了抗毒力项目，但现已不复存在。这种方法在学术界仍然很受欢迎，但尚未有化合物进入临床试验。”多年后，情况略有改善。大型制药公司仍然专注于其他治疗领域，而非传统抗生素的开发则由学术研究机构和小型生物技术公司的努力推动。新结核病药物工作组（一个主要的结核病非营利组织）的分析显示，所有结核病临床前项目中只有不到10%旨在开发抗毒力化合物，且尚未有进入临床试验。造成这种情况有几个相互关联的原因。首先，研发投资存在关键缺口，加之缺乏成本回收。其次，尽管不同的分枝杆菌毒力因子已被证明可以被小分子靶向，但临床前发现向临床实践的转化仍不清楚。最后，此类药物的临床意义以及将其纳入结核病药物方案的理解也不充分，需要比传统抗菌药物发现更复杂的研究。

总之，尽管抗毒力策略代表了对抗细菌感染（如结核病）的一种有前景且概念上创新的方法，但其临床转化仍然有限。当前形势凸显了学术兴趣与制药投资之间的显著差距，并伴随着科学、经济和监管挑战。弥合转化差距对于释放抗毒力疗法在对抗耐药病原体方面的全部潜力至关重要。