益生菌大肠杆菌Nissle 1917的内源质粒工程：实现无抗生素和无诱导剂的靛蓝生物合成

本研究创新性地利用低内毒素益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）的内源高拷贝质粒，构建了无需抗生素和化学诱导剂的靛蓝生物合成平台。通过系统代谢工程（如敲除竞争途径基因pheA/tyrA、解除trpR反馈抑制、过表达关键基因trpES40F/tnaA），显著提高了色氨酸前体供应和靛蓝产量（摇瓶达596.4 mg/L，5-L发酵罐达3041.6 mg/L），为传统化学合成法提供了绿色可持续的替代方案。

　　

Highlight

异源表达fmo基因使EcN能够实现从头合成靛蓝

有证据证实，在大肠杆菌中异源表达fmo基因可通过氧化催化促进靛玉红（indirubin）的生物合成。值得注意的是，由于靛蓝和靛玉红的结构同源性，黄素单加氧酶（FMO）同样可以催化形成3-羟基吲哚（3-hydroxyindole），随后其自发二聚化生成靛蓝。利用这一机理见解，我们系统地将fmo基因整合到EcN内源质粒的四个不同位点（I_1a, I_1e, I_2a, 和 I_2e），从而实现了无需外源载体、抗生素或诱导剂的靛蓝自主生物合成。

结论

总而言之，我们建立了一个基于益生菌的靛蓝生物合成平台，使用廉价的甘油作为碳源，消除了对诱导剂、抗生素或前体补充的需求。通过对色氨酸生物合成进行靶向工程和代谢途径优化，工程菌株EI16在5升生物反应器中通过补料分批发酵，在添加10.0 g/L色氨酸和1.25 g/L/h的甘油补料速率下，实现了3,041.6 ± 70.8 mg/L的靛蓝产量。