基于液液萃取与LC-MS/MS技术的毛发中多种大麻素检测方法开发与法医学应用

本研究针对毛发中痕量大麻素检测的灵敏度挑战，开发了一种基于LC-MS/MS的液液萃取方法，成功实现了THC、THC-OH、THC-COOH、CBN和CBD的同时检测，其中THC-COOH的定量下限达到0.2 pg/mg，符合SoHT标准。该方法通过验证显示良好的线性、精密度和准确度，并应用于大学生真实样本检测，结果与自述用药情况高度一致，为法医毒理学中主动吸食与被动暴露的鉴别提供了可靠技术支撑。

　　

随着全球范围内大麻医疗和娱乐用途的非罪化趋势，大麻已成为全球使用最广泛的非法药物。这不仅带来了公共健康担忧，也对社会安全构成挑战，例如吸食大麻后驾驶能力受损导致的交通事故。因此，准确监测大麻使用情况，特别是在法医毒理学领域，变得至关重要。传统的生物样本如血液和尿液只能反映短期内的药物使用情况，而毛发作为一种独特的生物基质，因其采集无创、检测窗口期长（可达数月）、稳定性高且易于储存等优势，正日益受到重视。然而，毛发分析也面临挑战，比如外部污染（如环境中的大麻烟雾）可能造成假阳性结果，而区分主动吸食与被动暴露是法医鉴定中的核心难题。关键依据在于检测THC的体内代谢产物，尤其是11-诺-9-羧基-Δ?-四氢大麻酚（THC-COOH），因为该物质只能通过人体代谢产生，是确认主动使用的“金标准”生物标志物。但由于其酸性强、在毛发中结合率极低，浓度通常极低（皮克/毫克级别），对检测方法的灵敏度提出了极高要求。为此，研究人员致力于开发更灵敏、更可靠的检测技术。

本研究旨在开发并验证一种稳健、灵敏的分析方法，用于同时检测和定量人发中的多种关键大麻素，包括Δ?-四氢大麻酚（THC）、其代谢物11-羟基-THC（THC-OH）和THC-COOH，以及大麻酚（CBN）和大麻二酚（CBD）。这项研究发表于《Food Wellness》期刊，为解决法医毒理学中准确鉴别大麻主动使用这一难题提供了新的技术方案。

为开展此项研究，作者主要运用了几个关键技术方法。首先，样本来源于大学学生志愿者提供的头发样本。核心的实验技术包括：1）样本前处理：采用甲醇洗涤去除表面污染物，随后进行碱水解（氢氧化钠/甲醇，50°C，30分钟）以释放毛发基质中的分析物；2）样品纯化与富集：使用液液萃取（LLE）技术，以正己烷/乙酸乙酯（90/10, v/v）作为萃取溶剂，进行净化与浓缩；3）高灵敏度检测：通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析，其中针对中性大麻素（THC, THC-OH, CBN, CBD）采用多反应监测（MRM）模式，而对痕量的酸性代谢物THC-COOH则采用了更特异的三重四极杆质谱（MS³）扫描模式，以达成所需的超高灵敏度。该方法严格遵循ANSI/ASB 036和FDA指南进行了全面验证。

3.1. 选择性与特异性

通过分析十个不同来源的空白毛发样本，证实该方法在目标分析物的保留时间和监测的离子对处无显著基质干扰。通过向空白样本中添加191种潜在干扰物质进行测试，结果显示目标分析物的色谱峰未受影响，同时同位素内标与目标分析物之间也无交叉干扰，表明方法具有高度的选择性和特异性。

3.2. 线性、LLOQ和LOD

方法在设定的工作范围内表现出良好的线性，各分析物的决定系数（R²）均大于0.99。定量下限（LLOQ）的确定符合规范，其中THC-COOH的LLOQ达到了0.2 pg/mg，这与SoHT推荐的确认主动使用的阈值一致。检测限（LOD）研究显示，方法能够清晰区分低浓度加标样本与空白样本。

3.3. 精密度与准确度

对日内、日间和中间精密度以及准确度的评估表明，所有分析物在不同浓度水平下的变异系数（CV）和相对误差（RE，偏差）均在±20%的可接受范围内，证明了该方法具有出色的重复性和可靠性。

3.4. 基质效应（离子抑制/增强）

评估发现，除THC-COOH在低浓度下离子抑制在可接受范围内外，其他分析物均存在明显的离子抑制现象。然而，通过增加不同来源基质的验证和采用同位素内标进行校正，确保了离子抑制不影响方法的定量下限和阳性结果的判定。

3.5. 回收率

各分析物的提取回收率在48.33%至104.71%之间，虽然部分值低于理想的80%-120%范围，但其表现出良好的一致性和可重现性，且未对方法的灵敏度、精密度和线性产生负面影响，因此被认为可以接受。

3.6. 处理过的样品稳定性

稳定性测试显示，THC、THC-OH、CBN和CBD在自动进样器（15°C）中可稳定保存72小时。但THC-COOH在LLOQ浓度下，放置24小时后即开始降解，48小时后变异系数急剧增大，72小时后则完全检测不到。这表明含有THC-COOH的样品应在提取后尽快分析，以防假阴性结果。

3.7. 残留

在最高浓度校准品后进样空白样本，仅THC-COOH的响应超过了LLOQ响应的20%。但由于低于LLOQ的结果不予报告，此残留不影响方法的适用性。

3.8. 应用于真实样本

该方法成功应用于189份大学生真实毛发样本。检测结果显示，THC浓度范围在5.17至609.74 pg/mg之间；仅有6份样本的THC-OH浓度高于LLOQ（50.04-81.92 pg/mg）；THC-COOH浓度在0.24至18.15 pg/mg之间；CBN和CBD也均有检出。部分样本仅检出THC而其代谢物为阴性，对这些样本的第二次甲醇洗涤液进行分析后发现了THC，提示存在外部污染。此外，有11份样本仅检出CBD，暗示可能为医疗用途。这些分析结果与志愿者填写的关于消费习惯的自填问卷高度一致，进一步验证了方法的实用性。数据分析表明，阳性结果主要集中在19-22岁、吸烟的男性群体中，最常消费的是大麻草，模式为每日使用。

本研究成功开发并验证了一种基于液液萃取结合LC-MS/MS和LC-MS³技术的分析方法，用于同时检测人发中的THC、THC-OH、THC-COOH、CBN和CBD五种重要大麻素。该方法的显著优势在于其高灵敏度，特别是对确认主动吸食至关重要的生物标志物THC-COOH的定量下限达到了0.2 pg/mg，完全符合SoHT的判定标准。同时，该方法仅需20毫克毛发样本，样品前处理过程相对简化（无需衍生化、固相萃取或阀切换系统），却实现了优异的分析性能。

研究的结论部分强调，该方法通过纳入THC-OH这一代谢物以及CBN和CBD等其他大麻素，提供了更全面的 cannabinoid 谱图，有助于更准确地区分主动使用与被动暴露，以及医疗用途与娱乐用途。对洗涤液的分析为进一步排除外部污染提供了有力证据。将分析结果与消费者的自述信息进行关联，证实了该方法在真实世界场景中的可靠性和实用性。

综上所述，这项研究为解决法医毒理学和临床毒理学中长期存在的毛发大麻素检测灵敏度与特异性难题提供了一个强大、高效且成本效益较高的解决方案。该方法不仅满足了当前毒物检测指南的严格要求，其简洁、稳健的特点也使其非常适合于常规的法医鉴定、 workplace testing（工作场所吸毒检测）以及药物滥用监测等高通量应用场景，具有重要的实际应用价值和推广前景。