医院未处理废水中抗生素抗性基因的迁移性、病原宿主及重金属/杀菌剂共选择机制解析

本研究针对医院未处理废水中抗生素抗性基因（ARGs）的环境与公共卫生风险，首次通过宏基因组组装方法，系统分析了三种不同类型医院废水中ARGs的丰度、移动性、病原宿主及其与金属抗性基因（MRGs）/杀菌剂抗性基因（BRGs）的共选择模式。研究发现1911个ARGs（222亚型）与大量MRGs、BRGs共存，其中46.43%的ARGs位于质粒上，且76.2%的中医医院废水ARGs属高风险；关键病原菌如肺炎克雷伯菌携带KPC-2、NDM-1等高危ARGs，并通过移动遗传元件（MGEs）介导水平基因转移。该研究为优化医院废水处理工艺、遏制抗生素耐药性传播提供了直接遗传证据和理论依据。

　　

在医院日常运营中，大量使用抗生素、重金属和消毒剂，使得医院废水成为抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）的“热点区域”。这些ARGs可能通过废水排放进入自然环境，甚至通过水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）传播给人类病原菌，对公共卫生构成严重威胁。然而，传统的污水处理工艺并不能有效去除这些抗性基因，特别是当它们与金属抗性基因（Metal Resistance Genes, MRGs）和杀菌剂抗性基因（Biocide Resistance Genes, BRGs）共存时，后两者可能通过共选择（co-selection）机制进一步促进ARGs的持久存在和传播。尽管已有研究利用短读长测序技术对医院废水中的微生物群落和ARGs分布进行了描述，但这些研究大多依赖于统计相关性，缺乏对ARGs与移动遗传元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）、MRGs/BRGs物理共定位的直接遗传证据，限制了我们对医院废水中抗生素耐药性传播风险的准确评估。

为了填补这一空白，由山西医科大学第一临床医学院的Feng Yanying、Yuan Qiheng、Kang Yutong、Zheng Meiqin和Li Zhenjun组成的研究团队，在《Infection, Disease》杂志上发表了一项研究，题为“Deciphering the mobility, pathogenic hosts, and co-selection of antibiotic resistance genes in untreated wastewater from three different hospitals”。该研究创新性地运用宏基因组组装技术，对来自综合医院（GH）、中医医院（TCMH）和口腔医院（SH）的9个未处理废水样本进行了深入分析，旨在揭示ARGs的遗传背景、病原菌宿主、移动性及其与MRGs/BRGs的共选择机制，为制定更有效的医院废水处理策略提供科学依据。

研究人员主要运用了几项关键技术方法：首先，从公共数据库（PRJNA723368）获取了9个未处理医院废水样本的宏基因组原始测序数据，这些样本代表了三种主要的医疗机构类型。接着，利用Trimmomatic进行质量控制，并使用MetaSPAdes进行宏基因组组装，获得更长的重叠群（contigs）。然后，通过比对SARG数据库（v2.0）和BacMet数据库（v2.0）分别鉴定ARGs以及MRGs和BRGs。为了评估ARGs的移动性，研究采用了PlasFlow预测质粒来源的序列，使用MOB-suite分析质粒的可移动性，并通过proMGE在线工具和Integrall数据库注释MGEs（包括重组酶、整合子等）。此外，利用mmsEqs将携带ARGs的重叠群与基因组分类数据库（GTDB）比对进行宿主溯源，并与已知病原菌列表比对以识别病原宿主，同时使用VFDB（毒力因子数据库）注释毒力基因，以区分“实际推定病原菌”和“潜在推定病原菌”。统计分析及可视化（如Procrustes分析、网络图等）则在R语言环境中完成。

研究结果揭示了医院未处理废水中ARGs的复杂景观及其传播风险：

3.1. ARG在三种不同医院废水中的分布和特征

研究在组装后的宏基因组中共鉴定到1911个ARG-like ORFs，归属于222个ARG亚型，16个ARG类型。四环素、多重耐药、β-内酰胺类、氨基糖苷类和MLS（大环内酯-林可酰胺-链阳菌素类）抗性基因是主要的ARG类型。三种医院废水中，中医医院（TCMH）的ARG总丰度最高，其次是综合医院（GH），口腔医院（SH）最低。值得注意的是，46.43%的ARGs位于预测为质粒来源的重叠群上，表明质粒是ARGs的重要储存库，但其中仅约1%被预测为可移动性质粒，提示质粒直接介导接合转移的作用可能有限。

3.2. 医院废水中ARGs的病原宿主

研究成功将350个携带ARGs的重叠群溯源到52种病原菌。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是携带ARGs最多的优势病原菌，其次为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）和屎肠球菌（Enterococcus faecium）。这些病原菌携带的ARGs覆盖了包括多重耐药、β-内酰胺类、万古霉素（如vanR, vanS）等在内的多种耐药类型。其中，15个重叠群同时携带ARGs和毒力基因，被归类为“实际推定病原菌”，风险更高。分布分析显示，GH和TCMH废水中的耐药病原菌负荷和多样性远高于SH。特别值得关注的是，在肺炎克雷伯菌中检测到碳青霉烯酶基因KPC-2和KPC-12，在鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中检测到OXA-23，这些基因对临床最后一道防线抗生素构成威胁。

3.3. ARGs的水平基因转移

Procrustes分析显示ARGs与MGEs的组成存在显著相关性。进一步分析发现，平均有33.03%（TCMH）、26.00%（GH）和9.90%（SH）的ARGs与MGEs（如酪氨酸重组酶Tyr、丝氨酸重组酶Ser、HUH、DDE家族重组酶）共同位于同一重叠群上。网络分析揭示了78个ARG亚型与MGEs的共现关系，其中氯霉素外排泵基因与DDE重组酶的共现最为常见。此外，研究还发现Ⅰ型整合子整合酶基因（intI1）与81个ARG亚型共存，包括碳青霉烯酶基因（如GES-5, VIM-2, NDM-1, IMP-1, KPC-2, IMP-8）。同时，鉴定出18个携带11种独特ARGs的温和噬菌体重叠群，表明转导也是ARGs潜在的传播途径。

3.4. 未处理医院废水中ARG的健康和环境风险

基于ARGs在人类相关环境中的富集程度、基因移动性和宿主致病性进行风险评估，结果显示TCMH、GH和SH废水中分别有76.20%、70.20%和64.40%的ARGs被归类为高风险（Rank I和II），凸显了未处理医院废水的高风险性。

3.5. 和 3.6. MRGs和BRGs在三种不同医院废水中的分布和特征

研究同时检测到丰富的MRGs（1662个，167亚型）和BRGs（916个，139亚型）。汞（Hg）、多金属、铜（Cu）、砷（As）抗性是主要的MRG类型；多杀菌剂、有机汞、过氧化物、酸、酚类化合物、双胍类和季铵盐化合物（QACs）是主要的BRG类型。TCMH和GH废水中的MRGs和BRGs总丰度均高于SH。

3.7. ARGs与BRGs/MRGs的共现模式

Procrustes分析证实了ARGs与MRGs以及ARGs与BRGs谱图之间存在显著整体相关性。平均23.35%（TCMH）、20.63%（GH）和13.14%（SH）的ARGs携带重叠群上至少同时存在一个BRG或MRG。遗传背景分析提供了直接的遗传证据：发现了360个同时携带ARGs和MRGs/BRGs的重叠群。其中，多重耐药基因与多杀菌剂抗性基因、多金属抗性基因的共定位最为普遍。研究还鉴定出384个ORFs同时被注释为ARGs和BRGs，1个ORFs同时被注释为ARGs、BRGs和MRGs，提示存在交叉抗性（cross-resistance）的可能性。对携带多个抗性基因的重叠群进行可视化，发现例如一个重叠群上同时存在gadA (acid), gadE/yhiE (acid), mdtE/yhiU (multi-biocide/multidrug), mdtF/yhiV (multi-biocide/multidrug)等8个抗性基因，为共抗性（co-resistance）机制提供了有力证据。

在讨论部分，作者强调了本研究的创新性在于通过宏基因组组装提供了ARGs与MGEs、MRGs/BRGs物理共定位的直接遗传证据，超越了以往基于相关性的推断。研究结果明确指出了未处理医院废水作为ARGs及其病原宿主和MGEs储存库与传播枢纽的重要角色。特别值得注意的是，中医医院废水表现出最高的ARGs、MRGs、BRGs丰度和风险等级，这可能与其广泛使用含金属离子的中药和消毒剂有关，这些物质可能对微生物群落施加更强的选择压力，促进共选择。

综上所述，该研究深刻揭示了未处理医院废水是抗生素耐药性传播的关键环节，其中存在大量高风险ARGs，这些基因可由重要病原菌携带，并借助多种MGEs（如质粒、整合子、转座子、噬菌体）进行水平传播，且与MRGs/BRGs存在显著的共选择现象。这些发现强调了当前医院废水处理工艺在去除抗性基因方面的不足，以及根据医院类型（特别是中医医院）制定针对性废水处理策略的紧迫性。研究结果为优化医院废水处理工艺、阻断抗生素耐药性在环境中的传播提供了坚实的科学基础，对保障公共健康和环境安全具有重要意义。未来的研究应关注医院废水中抗生素、金属和杀菌剂的具体浓度，以更深入地理解共选择驱动的耐药性演化动力学，并评估先进处理技术对ARGs和MGEs的去除效果。