木质素修饰纳米氧化锌花状颗粒的抗菌、抗生物膜、体外抗癌活性及种子萌发毒性研究

本研究针对传统纳米材料合成方法的环境毒性问题，开发了一种以木质素(Lignin)为模板的绿色合成方法，制备了木质素包裹的氧化锌纳米花(L-ZnONFs)。研究系统评估了L-ZnONFs的抗菌、抗生物膜、体外抗癌活性及对植物种子萌发的毒性。结果表明，L-ZnONFs对革兰氏阴性菌表现出更强的抗菌效果，并能有效诱导肝癌细胞HepG2凋亡，IC50值为135 ± 6.75 μg/mL，同时在低浓度下对萝卜种子萌发无显著毒性。该研究为开发可持续的纳米生物材料在医药和农业领域的应用提供了新策略。

　　

在纳米科技迅猛发展的今天，如何以环境友好、可持续的方式合成功能纳米材料，并将其安全有效地应用于生物医学和农业领域，是科研人员面临的重要挑战。传统的物理化学方法合成纳米颗粒往往涉及有毒试剂，存在潜在的环境和健康风险。因此，利用天然生物分子作为模板和还原剂进行纳米材料的绿色合成，已成为当前研究的热点。木质素，作为植物细胞壁中丰富的天然生物高分子聚合物，因其具有多种活性官能团、良好的生物相容性和可降解性，被认为是构建功能纳米材料的理想载体。氧化锌纳米颗粒(ZnO NPs)因其独特的半导体特性、良好的生物安全性以及被美国FDA认定为“公认安全”(GRAS)物质而备受关注，在抗菌、抗癌等领域展现出巨大潜力。然而，如何将木质素的优势与氧化锌纳米颗粒的功能相结合，开发出兼具高效生物活性和低环境毒性的新型纳米复合材料，并系统评估其生物效应，是推动其实际应用的关键。

为此，发表在《Industrial Crops and Products》上的研究论文《Lignin produced nano zinc oxide flower particles and their antimicrobial, antibiofilm, invitro anticancer activity and toxicity on seed germination》应运而生。该研究团队开发了一种简便的绿色合成方法，利用商业木质素成功制备了木质素包裹的氧化锌纳米花(L-ZnONFs)，并对其物理化学性质进行了全面表征。研究人员系统评估了L-ZnONFs的血液相容性、体外抗癌活性（以人肝癌细胞HepG2为模型）、抗菌活性（针对革兰氏阳性菌C. diphtheriae和革兰氏阴性菌E. coli, K. pneumoniae, S. typhi）、抗生物膜能力以及对萝卜(Raphanus sativus)种子萌发和生长的影响，旨在为这种新型生物纳米复合材料在治疗学和农业领域的应用提供科学依据。

为开展本研究，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，采用绿色合成法，以锌 acetate 为前驱体、木质素为还原剂和稳定剂，在碱性条件下制备L-ZnONFs，并通过紫外-可见光谱(UV-Vis)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)、X射线光电子能谱(XPS)等技术对合成的纳米材料进行形貌、结构、组成和化学态表征。其次，通过溶血实验评估材料的血液相容性。第三，利用MTT法检测L-ZnONFs对HepG2细胞的毒性，并计算半数抑制浓度(IC₅₀)。第四，采用基于Annexin V-FITC/7-AAD染色的流式细胞术分析细胞凋亡情况。第五，通过DCFH-DA探针检测细胞内活性氧(ROS)水平。第六，采用琼脂盘扩散法评估抗菌活性，并通过结晶紫染色法量化抗生物膜效果。最后，通过种子萌发实验观察L-ZnONFs对植物生长的潜在影响。研究所用细菌菌株由当地医学院赠送，HepG2细胞购自国家细胞科学中心。

4.1. 表征

通过一系列表征技术证实了L-ZnONFs的成功合成。UV-Vis光谱在375 nm处显示氧化锌的特征吸收峰。FTIR光谱显示了木质素的特征官能团（如O-H, C-H, 芳香环等）以及Zn-O键（在403-432 cm^-1）的振动峰，表明木质素成功包裹在ZnO表面。XRD图谱显示L-ZnONFs具有六方纤锌矿晶体结构，结晶度良好，平均晶粒尺寸为41.85 nm。FE-SEM和HR-TEM图像清晰展示了L-ZnONFs的花状形貌，花瓣边缘直径约为202.23 ± 23.41 nm，长度约为281.69 ± 49.04 nm，表面粗糙，这有助于提高其反应活性。EDS和元素Mapping分析证实材料主要由Zn、C和O元素组成。SAED图样和XPS分析进一步验证了材料的结晶性和Zn元素以Zn²⁺价态存在。

4.2. RBC（红细胞）溶血

溶血实验结果表明，在50, 100和200 μg/mL的浓度下，L-ZnONFs对山羊红细胞只引起轻微的溶血，显示出良好的血液相容性，这为其后续的生物医学应用提供了安全性基础。

4.3. 抗增殖活性

MTT实验显示，L-ZnONFs能以浓度依赖的方式抑制HepG2细胞的活力，其IC₅₀值为135 ± 6.75 μg/mL。形态学观察发现，经L-ZnONFs处理的细胞出现变圆、皱缩等凋亡特征。流式细胞术凋亡检测（Annexin V-FITC/7-AAD染色）进一步证实，L-ZnONFs处理主要诱导HepG2细胞发生早期和晚期凋亡，而坏死细胞比例极低，其效果与阳性对照药阿霉素(doxorubicin)类似。这表明L-ZnONFs的抗癌作用机制主要是通过诱导细胞凋亡而非导致细胞坏死来实现的。

4.4. 抗菌活性

琼脂盘扩散法结果显示，L-ZnONFs对测试的四种细菌均有抑制作用，且效果呈浓度依赖性。在80 μg/mL浓度下，对革兰氏阴性菌（K. pneumoniae, E. coli, S. typhi）的抑制效果优于革兰氏阳性菌（C. diphtheriae）。扫描电镜观察发现，经L-ZnONFs处理的细菌表面变得粗糙、皱缩，表明纳米材料破坏了细菌细胞膜的完整性。

4.5. 抗生物膜活性

结晶紫染色法定量分析表明，L-ZnONFs能有效抑制C. diphtheriae和E. coli的生物膜形成，且抑制作用随浓度增加而增强。对于C. diphtheriae，在400 μg/mL浓度下，生物膜抑制率高达98%。L-ZnONFs可能通过穿透生物膜基质、产生活性氧(ROS)破坏胞外聚合物等方式发挥抗生物膜作用。

4.6. 植物生长

种子萌发实验发现，与未处理的对照组相比，L-ZnONFs在较低浓度（如100 μg/mL）下对萝卜种子的萌发和幼苗生长没有表现出显著的抑制作用。但随着浓度升高（至400 μg/mL），对幼苗生长有一定的抑制效应，提示在实际农业应用中需要注意控制使用浓度。

5. 结论

本研究成功开发了一种基于木质素的绿色合成方法，用于制备具有花状形貌的氧化锌纳米复合材料(L-ZnONFs)。该材料展现出良好的血液相容性、显著的浓度依赖性抗菌和抗生物膜活性（尤其对革兰氏阴性菌），以及通过诱导凋亡有效抑制肝癌细胞HepG2增殖的能力。此外，在适当浓度下，其对植物种子萌发毒性较低。这些结果表明，木质素修饰的氧化锌纳米花在癌症治疗、抗菌制剂以及可持续农业化学品开发方面具有广阔的应用前景。该研究为设计和开发高效、低毒、可持续的纳米生物材料提供了新的思路和实验证据。未来的研究可进一步探索其体内活性和作用机制，并优化合成工艺和给药策略，以推动其向临床应用转化。