成纤维细胞铁死亡加重牙髓炎炎症反应的作用机制与治疗意义

本研究针对牙髓炎发病机制不清、传统根管治疗存在局限性的临床难题，聚焦铁死亡（ferroptosis）这一新型细胞死亡方式在牙髓炎症中的作用。研究人员通过整合临床样本分析、单细胞转录组测序和小鼠模型，首次揭示牙髓成纤维细胞是发生铁死亡的主要细胞类型，其铁死亡通过促进IL-6和IL-1β等促炎因子释放加剧炎症；而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）能够有效减轻牙髓炎症。该研究为牙髓炎的靶向治疗和活髓保存提供了新的理论依据和潜在策略。

　　

牙痛起来真要命，这可能是很多人对牙髓炎最直观的感受。牙髓炎是一种常见的口腔感染性疾病，当牙齿因龋坏、外伤等原因导致牙髓组织暴露于细菌（尤其是含有脂多糖LPS的病原体）等外源性刺激时，便会引发局部的非特异性免疫炎症级联反应，常常伴随着令人难以忍受的疼痛。若得不到及时有效的干预，炎症可能向根尖方向发展，进而导致根尖周炎、牙槽骨吸收，最终造成牙齿丧失。目前，牙髓炎的标准治疗方法是根管治疗（RCT），即彻底清除发炎的牙髓组织。然而，这种非保守的治疗方式会使牙齿失去活力，变得脆弱，长期来看增加了牙根断裂等并发症的风险。正是由于传统根管治疗的这些局限性，近年来牙科医学界正将目光转向以生物学为基础、旨在保留牙髓活力的新型治疗方法。因此，深入探究牙髓炎的发病机制，寻找调控炎症的关键分子靶点，对于开发保护牙髓活力的新策略至关重要。

近年来，一种名为铁死亡（ferroptosis）的细胞死亡方式引起了科学家的广泛关注。这是一种铁依赖性的、以脂质过氧化为主要特征的调节性细胞死亡。除了在肿瘤领域被广泛研究外，铁死亡也被发现与多种炎症性疾病的发生发展密切相关，例如脓毒症、关节炎、牙周炎和慢性根尖周炎。在牙周炎中，成纤维细胞会发生铁死亡，并与白细胞介素-6（IL-6）的分泌相关，从而促进疾病进展。那么，在同样由细菌感染引发的牙髓炎中，铁死亡是否也扮演了重要角色？如果是，又是哪种细胞发生了铁死亡？这成为了本研究旨在解答的核心科学问题。

为了回答这些问题，研究人员开展了一项多层次的研究，相关成果发表在《International Dental Journal》上。研究综合利用了公共数据库（GEO）的RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、临床采集的人牙髓组织样本、体外培养的人牙髓成纤维细胞（DPFs）以及小鼠牙髓炎模型。关键技术方法包括：对公共数据库和自行采集的人健康与炎症牙髓组织进行转录组分析；利用单细胞RNA测序技术解析牙髓组织的细胞组成并鉴定发生铁死亡的细胞类型；通过免疫组化（IHC）、免疫荧光共定位（如使用FSP1标记成纤维细胞，BODIPY C11 581/591探针检测脂质过氧化）等技术在组织和细胞水平验证铁死亡；建立小鼠牙髓暴露模型模拟牙髓炎，并腹腔注射铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）进行干预；在体外使用LPS刺激人牙髓成纤维细胞诱导炎症和铁死亡，并观察Fer-1的干预效果；通过CCK-8和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞活力和死亡，通过丙二醛（MDA）水平、铁离子染色（FerroOrange）和蛋白质印迹（Western blot）检测铁死亡关键指标（如GPX4、4-HNE）。

Ferroptosis is involved in inflamed dental pulp

研究人员首先通过分析公共数据库中的RNA-seq数据发现，与健康牙髓相比，牙髓炎组织中铁死亡相关基因PTGS2、HMOX1和SLC7A11的表达显著升高，且PTGS2的表达与炎症因子IL-1β和TNF-α的水平呈强正相关。对临床牙髓样本的检测进一步证实了这些发现：普鲁士蓝染色显示炎症牙髓组织存在铁过载；免疫组化结果显示脂质过氧化产物4-HNE表达上调，而铁死亡关键抑制因子GPX4的蛋白表达下调；实时定量PCR（RT-qPCR）也检测到PTGS2、HMOX1、SLC7A11以及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子mRNA水平的升高。这些结果共同表明，铁死亡参与了人牙髓炎的发病过程。

Fibroblasts were identified as the major cell type in dental pulp

为了在单细胞水平上探究牙髓炎的细胞异质性，研究人员对来自健康和炎症牙髓的单细胞RNA测序数据进行了深入分析。他们成功鉴定出7种主要的细胞群体：内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、间充质干细胞（MSCs）和单核细胞。比较分析发现，炎症牙髓的细胞景观发生了显著重塑：免疫细胞比例扩张了约3倍，而MSCs和上皮/内皮细胞比例减少至约三分之一。值得注意的是，成纤维细胞始终是牙髓中最主要的细胞成分，在健康牙髓中占比41.3%，在炎症牙髓中甚至升高至59.6%。同时，炎症牙髓中IL-1β和IL-6表达上调，铁死亡相关基因集评分也显著升高。这提示成纤维细胞可能在牙髓炎的铁死亡和炎症反应中扮演核心角色。

Fibroblasts were identified as the major cell type that underwent ferroptosis in inflamed dental pulp

接下来，研究团队深入探究了究竟是哪种细胞发生了铁死亡。单细胞数据分析显示，在炎症状态下，成纤维细胞和单核细胞中铁死亡相关基因集评分较高。具体而言，成纤维细胞中促铁死亡的基因PTGS2、ACSL4和HMOX1表达显著上调。为了验证这一发现，他们在人和小鼠的牙髓组织切片上进行了免疫荧光共定位实验。结果显示，在牙髓炎样本中，成纤维细胞标志物FSP1阳性的细胞同时显示出脂质过氧化探针BODIPY C11 581/591的强绿色荧光信号，且其强度显著高于健康对照，明确表明牙髓成纤维细胞在炎症环境下确实发生了铁死亡。

LPS-induced ferroptosis promoted production of pro-inflammatory cytokines in dental pulp fibroblasts

为了在体外模拟牙髓炎的炎症环境并探讨其机制，研究人员用细菌脂多糖LPS刺激体外培养的人牙髓成纤维细胞。结果发现，LPS处理会导致细胞活力下降、LDH释放增加、细胞内铁离子积聚、脂质过氧化水平（MDA和BODIPY C11信号）升高，同时伴随GPX4蛋白下调、4-HNE蛋白上调，这些均是铁死亡的典型特征。更重要的是，LPS刺激还显著促进了成纤维细胞产生IL-1β和IL-6等促炎因子。而当使用铁死亡特异性抑制剂Fer-1进行处理后，不仅上述铁死亡指标得到显著改善，促炎因子的释放也受到了明显抑制。这直接证明了LPS通过诱导牙髓成纤维细胞铁死亡，进而促进了炎症因子的产生。

Fer-1, a ferroptosis inhibitor, alleviated pulp inflammation in pulpitis in vivo

最后，研究在小鼠牙髓炎模型中验证了靶向铁死亡的 therapeutic potential。通过手术暴露小鼠上颌第一磨牙的牙髓成功诱导了牙髓炎，表现为组织学上的血管扩张、炎性细胞浸润以及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子表达升高。模型小鼠的牙髓组织也出现了铁过载（普鲁士蓝染色阳性）、GPX4下调、4-HNE上调等铁死亡特征。在造模前给予Fer-1干预，可以显著减轻牙髓的组织炎症程度，并部分逆转铁死亡标志物的异常表达和促炎因子的过度产生。值得注意的是，Fer-1的溶剂本身也显示出一定的抗炎效果，但Fer-1处理组表现出更强的炎症抑制能力，明确了其通过抑制铁死亡发挥作用的特异性。

综上所述，本研究通过多层次、多技术的整合分析，首次揭示了牙髓成纤维细胞铁死亡在牙髓炎发病机制中的关键作用。研究结论表明，在细菌感染等因素引发的牙髓炎症中，成纤维细胞作为牙髓组织的主要细胞成分，会发生铁死亡。这一过程不仅直接导致细胞损伤，更重要的是会促进IL-6和IL-1β等关键促炎因子的释放，从而放大和加剧局部的炎症反应，形成恶性循环。而应用铁死亡抑制剂Fer-1则能有效阻断这一过程，减轻炎症，为牙髓组织的修复创造有利条件。

在讨论中，作者强调了该研究的创新性和意义。它将铁死亡这一前沿概念与常见的口腔疾病牙髓炎联系起来，为理解牙髓炎的复杂病理生理机制提供了全新的视角。同时，研究也指出了当前铁死亡检测方法的挑战以及牙髓炎中可能存在其他细胞死亡方式（如凋亡、坏死性凋亡等）与铁死亡的交叉对话，这为未来研究指明了方向。最重要的是，该研究结果表明，靶向成纤维细胞铁死亡有望成为一种新的治疗策略，为开发旨在保存牙髓活力的生物学疗法提供了潜在靶点，对于推动牙髓病治疗从传统的“根管治疗”向“活髓保存”的范式转变具有重要的启发意义。当然，研究也存在一些局限性，如人类样本的异质性、以及铁死亡上游激活信号通路尚未完全阐明等，这些都需要在未来通过基因敲除等更精细的实验手段进行深入探索。