代谢调控与突触稳态：REST/NRSF通过糖酵解抑制调控兴奋性神经传递的新机制

《Journal of Physiology》：Harnessing metabolic control for synaptic stability: REST/NRSF links glycolytic inhibition to excitatory neurotransmission

本研究发现糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）通过降低NADH/NAD+比率激活转录抑制因子REST/NRSF，诱导其核转位，进而选择性下调兴奋性突触后膜GluA2亚基的表达，实现兴奋性/抑制性（E/I）平衡的稳态调节。该机制为理解代谢干预（如生酮饮食）的抗癫痫作用提供了新视角，揭示了REST/NRSF通路在连接代谢与神经兴奋性中的关键作用。

　　

代谢控制与突触稳定性：REST/NRSF将糖酵解抑制与兴奋性神经传递联系起来

摘要

在静息状态下，大多数神经元ATP通过线粒体氧化磷酸化产生，而在强烈的神经元放电期间，糖酵解变得更加重要。近期研究表明，抑制糖酵解在调节癫痫相关过度兴奋中起关键作用，当糖酵解抑制降低NADH/NAD⁺比率时，表观遗传调节因子REST/NRSF被激活。本研究探讨了REST/NRSF在糖酵解抑制对海马神经元活动影响中的作用。用2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）处理可降低NADH/NAD⁺比率，增加REST/NRSF表达，并促进其核转位。虽然GABA能抑制性输入以及兴奋性和抑制性神经元的放电特性不受2DG影响，但诱发的兴奋性突触后电流（eEPSCs）和微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的振幅以REST/NRSF依赖的方式减小。这种效应与REST/NRSF依赖性的GluA2阳性斑点尺寸减小以及GluA2表达降低相关，而兴奋性突触的密度没有变化。这些发现揭示了REST/NRSF依赖通路在2DG介导的兴奋性输入下调中的作用，该机制有助于神经元网络的稳定性，增强了对抗过度兴奋的稳态防御。

关键点

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  用2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）减少葡萄糖代谢会降低细胞的能量平衡，并增加称为REST/NRSF的基因调节因子的水平。
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  REST/NRSF随后进入细胞核，在那里它控制与神经细胞通信相关的基因活性。
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  2DG减弱了兴奋性神经细胞之间的信号强度，而不影响抑制性信号或神经元放电的基本能力。
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  这种效应部分依赖于REST/NRSF，它减少了兴奋性突触处含GluA2的AMPA受体的数量和大小，而不改变兴奋性接触的总数。
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  这些发现表明，阻断葡萄糖代谢会激活一种保护性反应，从而稳定大脑网络，这可能有助于控制癫痫发作。

引言

癫痫影响着全球超过6500万人，其中约三分之一的患者对经典的抗癫痫药物（ASDs）耐药。过去三十年中，人们对使用高脂肪、低碳水化合物的生酮饮食（KD）及其变体（如中链甘油三酯（MCT）饮食、改良阿特金斯饮食（MAD）和低血糖指数治疗（LGIT））作为药物耐药性癫痫的替代疗法的兴趣日益增长。这些饮食的共同特点是显著减少碳水化合物摄入，导致糖酵解减少。这一观察结果，结合即使是最少量的碳水化合物摄入也能消除KD实现的癫痫控制的发现，促使评估限制糖酵解通路的药物（如2-脱氧-D-葡萄糖（2DG））的抗癫痫作用的研究迅速增加。

2DG是一种葡萄糖类似物，可阻止葡萄糖-6-磷酸异构化为果糖-6-磷酸，从而可逆地抑制糖酵解。临床前研究已证明其作为抗癫痫药物的巨大潜力。在体外，2DG可在各种模型中减少癫痫样活动，包括由高细胞外K⁺、4-氨基吡啶和荷包牡丹碱诱导的模型，以及在GABA能突触活动阻断下的海马切片中。其功效延伸至体内模型，在点燃、听源性发作和毛果芸香碱诱导的癫痫等条件下，它已被证明可以延迟或减轻癫痫发作。

2DG的作用机制复杂且多方面，根据其急性或慢性效应涉及不同的通路。急性地，当神经元活动高时，2DG主要通过突触前机制降低自发性EPSCs（sEPSCs）的频率和振幅。此外，2DG通过激活神经类固醇生成，增强突触外强直性GABA能电流，从而增强GABA能信号传导。

然而，2DG最引人入胜的效应与慢性治疗相关，这涉及旨在加强稳态可塑性过程的转录效应，这些过程对于神经元网络兴奋性的长期控制至关重要。例如，2DG介导ATP敏感性K⁺（K_ATP）通道亚基Kir6.1和Kir6.2的上调。这些通道在ATP因糖酵解抑制而降低时打开，促进K⁺外流，导致细胞超极化和兴奋性降低。

另一个引人注目的机制涉及转录抑制因子REST（RE1沉默转录因子），也称为NRSF（神经元限制性沉默因子），它是神经元稳态的主要调节因子。REST/NRSF及其辅抑制因子、NADH敏感的羧基末端结合蛋白（CtBP）由与2DG处理相关的细胞内NADH减少激活。它们共同靶向基因如Bdnf和TrkB的启动子区域，在大鼠颞叶癫痫点燃模型中减少癫痫发作进程。

在本研究中，我们研究了REST/NRSF在长期（48小时）2DG处理对原代海马神经元放电特性和突触传递的影响中的参与。我们观察到2DG促进REST/NRSF表达和核转位。虽然兴奋性和抑制性神经元的放电特性以及抑制性GABA能输入的强度未受影响，但2DG诱导了兴奋性谷氨酸能传递的下调，该下调依赖于REST/NRSF。潜在机制明显是突触后性的，并归因于AMPA型谷氨酸受体GluA2亚基表达的特定减少。

这些发现强调了糖酵解抑制以降低神经元过度兴奋倾向的方式改变神经元转录谱的能力。这是通过招募和激活转录抑制因子REST/NRSF来实现的，它协调了一个协调的基因程序，将大脑回路活动维持在生理限度内。

结果

糖酵解抑制不会损害神经元存活

严重的低血糖已知会诱导神经元死亡。原代神经元的标准培养基含有比小鼠脑脊液中生理水平（1-2 mM）高得多的葡萄糖浓度（25 mM）。这种差异对于维持体外神经元存活是必要的，因为氧化应激增加、代谢需求升高以及星形胶质细胞的代谢支持有限。为了确定在不损害神经元存活的情况下抑制糖酵解的最佳条件，我们首先评估了在降低的葡萄糖浓度（25、10、5和2 mM）下维持1至4天的海马神经元中的细胞死亡。在这些条件下未观察到细胞死亡的显著增加（约20%）。基于此结果，我们接下来使用葡萄糖/2DG组合（恒定比例为1:2）进行剂量反应存活实验。我们发现神经元存活率在10/20 mM时最佳，而在较低葡萄糖浓度下的葡萄糖/2DG组合导致神经元死亡逐渐增加。最后，我们测试了10/20 mM葡萄糖/2DG组合在长时间处理期间（24、48、72和96小时）的效果，发现即使在持续暴露后也没有显著的神经元存活率降低。因此，我们在整个实验中使用20 mM 2DG，以尽量减少由应激或细胞毒性引起的混杂效应。

糖酵解抑制降低NADH/NAD⁺比率并诱导REST/NRSF向细胞核的转位

糖酵解是产生ATP和NAH的关键代谢途径，NADH是细胞代谢中重要的电子载体。当神经元糖酵解被2DG处理抑制2小时，NADH相对于NAD⁺的水平降低，导致NADH/NAD⁺比率显著降低。糖酵解衍生的NADH已知是REST/NRSF辅抑制因子CtBP的变构调节剂，调节其与REST/NRSF的相互作用。因此，CtBP可以作为一种氧化还原传感器，直接整合代谢需求与基因表达。为了研究REST/NRSF的转录活性，用Cy3标记的诱饵寡脱氧核苷酸处理原代海马神经元，该寡核苷酸与REST的RE1结合域互补，并经过化学修饰以提高其稳定性，用于追踪内源性REST/NRSF。随机诱饵寡脱氧核苷酸序列（Cy3-NEG）作为阴性对照。有趣的是，在用2DG处理4小时后，Cy3-ODN进入细胞核的分配比率增加了一倍，而Cy3-NEG的细胞质分布不受影响。这些结果表明，糖酵解抑制激活了REST/NRSF从细胞质到细胞核的转位。

糖酵解抑制上调REST/NRSF

已知神经元REST/NRSF水平在生理条件下较低，但在应激诱导刺激（如癫痫发作、缺血或神经炎症）下会升高。用2DG处理培养的海马神经元6小时导致Rest/Nrsf mRNA水平显著增加，这种效应持续长达12小时。此外，有研究表明，糖酵解抑制减少了大鼠点燃模型海马中观察到的BDNF上调。因此，我们研究了2DG处理是否能在我们的体外条件下改变Bdnf转录。我们观察到2DG对这种在癫痫发生过程中起关键作用的神经营养素的转录没有影响。相反，2DG处理24小时导致REST/NRSF蛋白表达增加，这与在较短处理时间（6和12小时）观察到的mRNA水平增加一致。

2DG不影响兴奋性和抑制性神经元的放电活动

由于Na⁺通道是主要的神经元REST/NRSF靶点，并且被REST/NRSF下调，我们假设2DG处理可能通过REST/NRSF激活影响神经元放电特性。为了测试这种可能性，研究了在通过寡脱氧核苷酸（ODNs）抑制REST/NRSF后，用2DG处理48小时对放电活动的影响，这些ODNs将转录因子从其基因组结合位点分离。在电流钳配置下使用膜片钳记录，以递送幅度递增的恒定电流脉冲，并测量从GAD67-GFP小鼠获得的培养海马神经元中产生的动作电位（AP）放电。正如先前所示，GFP阴性的谷氨酸能兴奋性神经元显示出比GFP阳性的GABA能中间神经元更低的放电频率。在响应250 pA电流注入的最大瞬时放电频率显示，无论是用2DG处理48小时还是用2DG + ODN处理，都不影响兴奋性和抑制性神经元的AP放电频率。在研究2DG和ODN对单个AP的半宽和峰值幅度的影响时，获得了相同的结果，并且兴奋性和抑制性神经元描述AP波形和被动膜特性的所有其他参数也没有变化。与2DG或REST/NRSF抑制完全无效一致，免疫印迹分析显示电压门控Na⁺通道（Na_V）的表达水平没有显著变化。这些数据表明，神经元糖酵解的抑制不会引起抑制性和兴奋性神经元兴奋性的任何变化。

糖酵解抑制诱导REST/NRSF依赖的兴奋性突触强度下调

海马神经元作为自体突触细胞生长，使得能够研究来自同质突触群体的突触强度和突触传递的量子参数的变化。因此，使用膜片钳记录检查糖酵解抑制对从GAD67-GFP小鼠获得的自身突触神经元中诱发的eEPSCs或eIPSCs的影响。在GFP阴性的兴奋性自身突触神经元中，用2DG处理48小时使eEPSC振幅减半，这种效应被与ODN共同处理完全阻止。这种减少发生在配对脉冲比率（PPR）没有显著变化的情况下，表明是突触后机制。相反，GFP阳性的抑制性自身突触神经元对2DG不敏感，eIPSC振幅和PPR没有可检测的变化。这些发现表明，2DG选择性地抑制兴奋性突触强度，同时完全保留抑制性突触传递。这种选择性作用突出了2DG通过特异性调节兴奋性突触来降低兴奋性/抑制性（E/I）平衡的能力。

2DG诱导兴奋性突触中易释放池大小的REST/NRSF依赖性减少，而不影响释放概率

为了更好地定义糖酵解抑制调节谷氨酸释放的机制，我们使用累积振幅分析估计了同步释放的易释放池（RRP_syn）和释放概率（Pr）。当兴奋性自身突触受到持续2秒的40 Hz刺激训练挑战时，在刺激期间eEPSCs的显著抑制变得明显，与训练中第一个电流的幅度无关。我们分析了eEPSC振幅的累积曲线，该曲线显示初始快速上升，随后在后期脉冲期间出现较慢的线性增加。假设慢线性增加归因于突触小泡释放和恒定补充之间的平衡，将线性部分反向外推至单个神经元的时间0，得到总释放减去总补充，对应于RRPsyn。在NEG处理的神经元中，2DG减慢了累积电流的初始上升，达到显著更低的平台水平，从而降低了平均RRP_syn。2DG的这种效应在ODN处理的神经元中几乎被消除。相反，Pr（计算为训练中第一个EPSC（I₁）与RRP_syn的比率）在NEG处理或ODN处理的神经元中均不受2DG影响。这些数据证明，2DG诱导的eEPSC振幅减少是由于RRP_syn的减少。

还使用高渗刺激估计了RRP和Pr。在电压钳制的海马神经元上，最初以低频率（0.05 Hz）进行传入纤维刺激以诱发最大eEPSCs。一分钟后，将高渗溶液局部应用于同一神经元。正如先前所述，由高蔗糖应用诱导的瞬态电流的电荷转移——一种已建立的总RRP（RRP_tot）测量方法——在NEG/2DG处理的神经元中显著减少。相反，在Pr（计算为eEPSC电荷与RRP_tot的比率）中没有观察到显著差异。

糖酵解抑制导致mEPSC振幅的REST/NRSF依赖性减少

通过累积振幅分析和高渗刺激方法观察到的RRP减少可以解释为可用于释放的突触小泡数量的减少（量子含量）或由单个小泡融合产生的电流的减少（量子大小）。微型EPSCs（mEPSCs）的研究无疑是最有效的功能评估这些方面的方法。具体来说，mEPSCs的振幅反映了神经递质的突触后效应，并取决于突触后膜上存在的谷氨酸能受体的数量。相反，mEPSC频率主要取决于与膜片钳记录的神经元接触的活性兴奋性突触的数量。在电压钳制在-70 mV的神经元胞体上连续记录mEPSCs，并局部灌注含有TTX（1 μM）和荷包牡丹碱（30 μM）的Tyrode溶液以阻断自发性APs和GABA能突触后电流。2DG处理显著降低了mEPSC振幅，这种效应在通过ODN阻断REST/NRSF活性的神经元中被完全抑制。相反，mEPSC频率和动力学在未处理组和2DG处理组神经元之间保持可比性。这些发现表明，糖酵解抑制在没有改变活性突触接触数量的情况下，诱导了谷氨酸能受体表达的REST/NRSF依赖性减少。

糖酵解抑制降低AMPA谷氨酸受体GluA2亚基的表达

为了确认2DG对胞体或更远侧树突区域兴奋性谷氨酸能突触数量没有任何影响，我们使用针对Homer和VGLUT1的抗体对海马神经元进行双重免疫染色，分别标记兴奋性突触后支架和突触前末端。双标记兴奋性突触分布的形态计量学分析证实，2DG处理不影响细胞体和远侧树突水平的兴奋性突触密度。

由于REST/NRSF被各种神经元损伤激活被报道会影响AMPA型谷氨酸受体的GluA2亚基的表达，我们使用针对VGLUT1和GluA2的抗体重复了原代海马神经元的双重染色。兴奋性突触斑点的分析显示，在通过2DG抑制糖酵解后，GluA2的积分荧光强度显著降低。这种效应依赖于REST/NRSF的转录活性，因为它被ODN处理完全阻止。在原代皮层神经元总裂解物中对GluA2和VGLUT1的免疫印迹分析证实了免疫细胞化学的发现，证明2DG处理降低了GluA2表达，而不影响VGLUT1水平。同样，通过ODN抑制REST/NRSF完全阻止了GluA2的下调，证实了REST/NRSF在这一过程中的参与。

为了评估GluA2表达减少的功能后果，我们使用IEM-1460（一种GluA2缺失的AMPARs的选择性阻断剂，100 μM）检查了GluA2缺失的AMPARs对自身突触海马神经元中诱发的EPSCs的贡献。在对照（载体/NEG处理）神经元中，IEM-1460将EPSC振幅降低了约20%，这与成熟（14-16 div）兴奋性神经元中已知的含GluA2的AMPARs的低流行率一致。然而，在NEG/2DG处理的神经元中，IEM-1460诱导的阻断增加到约50%，表明GluA2缺失的AMPARs显著增加。这一电生理证据独立验证了生化发现，支持在糖酵解抑制后GluA2亚基的REST/NRSF依赖性下调。

糖酵解抑制抑制自发性网络活动，REST/NRSF起显著但非排他性作用

为了研究糖酵解抑制对整体神经元网络活动的影响，用NEG或ODN在载体（veh）或2DG存在下处理原代皮层神经元48小时。然后使用48孔多电极阵列（MEA）记录自发性放电活动。正如先前报道的，用ODN阻断REST/NRSF活性48小时对自发性网络放电没有影响，与NEG处理的神经元相比。

2DG对网络活动的影响及其与REST/NRSF的相互作用是复杂的。用2DG处理48小时显著降低了平均放电率、爆发频率、爆发内尖峰百分比和同步化指数。然而，这些抑制性稳态效应仅部分依赖于REST/NRSF，因为它们仅被ODN处理部分逆转。相反，2DG诱导的爆发持续时间和网络爆发频率的减少完全依赖于REST/NRSF，因为它们被ODN完全阻断。此外，2DG对网络爆发持续时间和爆发内尖峰间隔的影响是REST/NRSF独立的，因为尽管有伴随的ODN处理，它们仍然保持不变。

这些发现证明，糖酵解抑制通过复杂的机制相互作用强烈抑制神经元网络活动，其中REST/NRSF起显著但非排他性作用。

讨论

尽管抗癫痫药物广泛可用且其控制癫痫发作的疗效已得到证实，但癫痫不能被视为一种有效可治愈的神经系统疾病。抗癫痫药物并不解决源于癫痫灶中E/I失衡的癫痫发作的主要原因。相反，它们通过引入额外的继发性功能改变来补偿这种失衡。虽然这种方法在预防癫痫发作方面有效，但它创造了一种人为且往往不稳定的平衡，显著影响了患者的生活质量，这些患者从癫痫控制中受益，但同时也遭受认知障碍、记忆缺陷、镇静和情绪改变，进一步加剧了癫痫的心理和社会负担。鉴于这些挑战，越来越多的注意力转向饮食疗法，如KD及其变体MCT、MAD和LGID，这些疗法通过模拟禁食来抑制癫痫发作。所有上述饮食方案的特点都是严格减少碳水化合物摄入，导致糖酵解减少或抑制。这些考虑，结合即使是最少量的碳水化合物摄入也能消除KD实现的癫痫控制的观察，导致研究限制糖酵解通路的药物（主要是2DG）的抗癫痫效应的研究迅速增加。这种葡萄糖类似物抑制糖酵解，模拟低碳水化合物饮食的抗癫痫作用。

大量可靠的体内研究已在小鼠和大鼠模型中证明了2DG的强大抗癫痫和疾病修饰效应。在几种癫痫模型中报道了急性抗惊厥作用。此外，在创伤性脑损伤模型中，经受受控皮质冲击并用2DG急性治疗1周的小鼠表现出减少的癫痫样活动、突触E/I平衡的恢复以及小清蛋白阳性中间神经元的保留。关于长期安全性，在成年大鼠中长达6个月的2DG慢性给药（剂量高达500 mg/kg/天）显示出良好的行为学和全身安全性。未观察到行为表现、认知功能或常规临床参数的显著改变，表明长期低剂量治疗具有良好的耐受性。此外，临床肿瘤学研究已经记录了人类在剂量范围从60到250 mg/kg下2DG的可接受耐受性，特别是在间歇性或低剂量方案下。这些广泛的临床前发现现在正得到一项目前正在研究2DG在成人耐药性癫痫中安全性和有效性的II期临床试验的补充。最后，2DG与代谢疗法（如KD、MCT或LGID）的组合已被证明可以增强癫痫控制并进一步减少糖酵解通量，从而加强了其转化潜力。尽管体内数据清楚地突出了2DG的抗癫痫功效和耐受性，但其精确的作用机制仍未完全了解，并且其在实验模型中可变的有效性需要进一步研究以完善其治疗应用。

在本研究中，我们对2DG可能激活的潜在稳态效应进行了全面分析，特别评估了表观遗传调节因子REST/NRSF在2DG介导效应机制中的贡献。我们在生理条件下、具有正常电活动水平的神经元中进行了这一分析，因为已经充分确定，REST/NRSF的稳态作用可以在体外被神经元过度兴奋条件直接激活，并在体内被各种损伤（如癫痫发作）激活。因此，在这种情况下，目标是评估2DG直接激活REST/NRSF介导的稳态通路的能力，并排除与神经元过度兴奋诱导的其他稳态因子（如NPAS4）潜在重叠的可能性。

我们的数据表明，长期2DG处理被海马神经元体外良好耐受，增加REST/NRSF表达及其向细胞核的转位，并诱导NADH/NAD⁺比率的降低，正如先前在响应2DG和低血糖中观察到的。先前已有报道，减少的糖酵解以及随之而来的NADH水平降低增加了CtBP在Scn2A和BDNF的RE1元件上的占据，有效地证明CtBP可以增强REST/NRSF依赖的抑制因子活性。然而，在我们的研究中，我们没有观察到BDNF转录的下调，这与先前在用2DG处理的大鼠颞叶癫痫点燃模型中的报道相反。这种差异主要归因于两种实验模型之间的实质性差异。很可能在以显著神经元过度兴奋为特征的点燃模型中实现的REST/NRSF水平，相对于我们的实验条件显著更高。在该模型中，REST/NRSF激活由癫痫发作活动和2DG处理共同驱动，导致能够抑制更广泛靶基因（包括Bdnf）的组合效应。相比之下，在我们的研究中，我们使用野生型神经元，因为我们的目标是研究2DG在健康完整神经元网络中、在基础条件下、没有任何惊厥剂的情况下触发的稳态过程，其中REST/NRSF水平相当低。这可能导致更温和的REST/NRSF激活，并因此对其靶基因产生更具选择性的抑制。确实，已经充分确立，由REST/NRSF调节的基因库取决于其激活水平，因为不同的靶基因对REST/NRSF及其辅抑制因子表现出可变的亲和力。

另一个意想不到的结果是，由2DG诱导的REST/NRSF的稳态效应对于突触后分子机制的选择性。确实，在先前的工作中，我们观察到在由惊厥剂4-氨基吡啶诱导的过度兴奋条件下，REST/NRSF激活降低了兴奋性神经元的放电频率，并对兴奋性（下调）和抑制性（上调）突触产生相反的突触效应，这些效应严格在突触前水平实现。在这项研究中，我们没有观察到对兴奋性神经元放电活动的任何影响，也没有检测到GABA能抑制性传递的变化。2DG诱导REST/NRSF的唯一效应是突触后水平谷氨酸能传递强度的下调。REST/NRSF激活在神经元过度兴奋或糖酵解抑制下触发的不同稳态过程突出了不同刺激如何以不同方式激活REST/NRSF，导致不同的结果。这很可能是由于REST/NRSF激活程度的不同，以及招募了不同的REST/NRSF辅因子，导致差异化的转录重塑。这些差异可以证明为什么最终的功能效应可能 substantially diverge。

我们的数据表明，依赖于REST/NRSF激活的突触后作用机制导致GluA2的下调。这一发现得到mEPSC频率和PPR没有变化的支持，并且累积振幅分析排除了神经递质释放概率的改变。同时，蛋白质印迹、免疫细胞化学和IEM-1460诱导的AMPAR阻断幅度的增加强烈暗示AMPA受体GluA2亚基的下调是eEPSC振幅减少的主要机制。这种效应反映了在经历全局缺血的神经元网络中的先前观察，其中激活的REST/NRSF结合到GluA2启动子中的RE1元件，沉默GluA2亚基的表达。这一点至关重要，因为GluA2作为AMPARs的“离子守门员”，缺乏GluA2的AMPARs变得对Ca²⁺离子可渗透（Ca²⁺可渗透的AMPARs）。值得注意的是，缺乏GluA2的AMPARs仍然可以作为信号分子，并与各种形式的突触可塑性相关，包括稳态调节。因此，2DG可能激活两个不同的REST/NRSF依赖性稳态通路：（i）常规AMPARs功能的减少导致兴奋性突触强度降低，和（ii）由于GluA2亚基下调导致通过Ca²⁺可渗透的AMPARs的Ca²⁺内流增加，这可能招募额外的稳态通路。

同样有趣的是，海马主要神经元表达高水平的GluA2，导致快速突触传递和最小的Ca²⁺内流。相比之下，许多GABA能中间神经元拥有向内整流的Ca²⁺可渗透的AMPARs，这与GluA2 mRNA的低丰度相关。因此，REST/NRSF对GluA2亚基的特异性下调构成了一种稳态机制，通过选择性地减少投射到主要神经元的兴奋性输入的突触强度来对抗神经过度兴奋。相反，这种效应在靶向抑制性神经元的兴奋性突触处几乎不存在，因为它们本质上缺乏GluA2亚基。

尽管2DG诱导的兴奋性突触强度下调完全依赖于REST/NRSF，但自发性网络活动的MEA记录揭示，2DG的稳态效应并非 solely mediated by REST/NRSF induction。具体来说，2DG以完全REST/NRSF依赖的方式减少爆发持续时间和网络爆发频率。然而，一些关键参数，如平均放电率、同步化指数、爆发内尖峰百分比和爆发频率，仅部分依赖于REST/NRSF活性，而其他参数，如网络爆发持续时间和爆发内尖峰间隔，则完全独立于REST/NRSF。这表明额外的通路有助于2DG对网络动力学的影响，突出了2DG参与的稳态机制的复杂性。

先前的研究表明，2DG抑制Bdnf及其受体TrkB的转录，这两者对于点燃进程都至关重要；上调ATP敏感性K⁺通道，促进膜超极化和兴奋性降低；通过神经类固醇合成增强强直性GABA能电流；减少氧化应激；刺激AMP活化蛋白激酶。这些多层面的作用可能共同抑制网络过度兴奋和异常同步，这是癫痫活动的两个标志。综上所述，我们的发现表明，2DG降低网络同步性和兴奋性的能力源于突触和内在机制的并行作用。这种双重作用可能 underlie its reported anti-seizure efficacy，正如在多项