EB病毒、低维生素D、少日照与HLA-DRB1 * 1501风险等位基因通过共同表观遗传通路导致多发性硬化发病

本研究揭示了EB病毒（EBV）感染、低血清25-羟基维生素D（25(OH)D）、少日照以及HLA-DRB1 * 1501风险等位基因通过共同的DNA甲基化（DNAm）表观遗传通路协同作用，影响多发性硬化（MS）发病风险。研究发现，上述风险因素对MS风险的关联中有21%至53%是由特定的DNAm模块介导的，这些模块富集的通路（如干扰素信号、NOTCH信号）具有跨研究一致性，为理解MS的多因素病因提供了新的分子机制见解。

　　

研究背景

多发性硬化（MS）是一种复杂的中枢神经系统自身免疫性疾病，其发病风险受到多种环境和遗传因素的共同影响。已知的风险因素包括爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）感染（尤其表现为传染性单核细胞增多症（IM）病史和较高的抗EBNA IgG抗体滴度）、较低的血清25-羟基维生素D（25(OH)D）水平、较低的阳光暴露以及HLA-DRB1 * 1501风险等位基因。然而，并非所有EBV血清阳性个体都会发展为MS，这表明辅助因素在疾病发生中扮演重要角色。这些风险因素之间已被证明存在交互作用，支持MS风险的多因素性质及其相互依赖性，但其潜在的分子机制尚不清楚。

表观遗传学，特别是DNA甲基化（DNAm），作为可遗传且可修饰的遗传调控机制，代表了环境和遗传因素影响基因组的一个界面。MS患者在外周血和中枢神经系统（CNS）中均存在差异DNAm谱。这表明MS风险因素可能通过诱导表观遗传编程参与MS的发病机制。中介分析表明，当风险因素通过中介因子对结局产生影响时，即发生了中介效应。DNAm已知对环境（如EBV、维生素D状态）和遗传（如HLA-DRB1 * 1501）因素均有反应，因此是潜在的中介因子。此外，多种遗传和环境因素可能通过共同的表观遗传途径发挥作用。本研究旨在利用降维方法构建MS相关的DNAm模块，并评估这些模块作为风险因素与MS关联的中介因子作用。

材料与方法

本研究分析了来自两项病例对照研究的数据：澳大利亚的Ausimmune研究（2003-2007年）和瑞典的MS流行病学调查（EIMS，2005-2011年）。Ausimmune研究是一项多中心发病匹配病例对照研究，纳入了206例首次临床诊断（FCD）且绝大多数在10年随访时转为MS的病例以及348名匹配对照。EIMS研究是一项瑞典的MS病例对照研究，本研究使用了其DNAm数据子集，包括140例MS病例和139名匹配对照。两项研究均收集了详细的流行病学数据、生物样本用于血清学指标（如25(OH)D、抗EBNA抗体）检测、基因分型（HLA-DRB1 * 1501）和全基因组DNAm分析（Ausimmune使用Illumina EPIC 850K芯片，EIMS使用450K芯片）。

统计分析包括：1）使用多变量逻辑回归评估各风险因素与MS风险的个体和联合（加性和乘性交互作用）关联；2）使用降维方法（Ausimmune使用加权基因共表达网络分析（WGCNA），EIMS使用稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA））构建MS相关的DNAm模块；3）使用反事实中介分析（R软件的medflex包）评估DNAm模块作为风险因素-MS关联的中介因子；4）通过通路富集分析（如Reactome、Gene Ontology）和上游转录因子推断（Lisa平台）来描述中介性DNAm模块的生物学特征。所有分析均对匹配因素和潜在混杂因素（如细胞类型比例、 ancestry）进行了调整，并进行了多种敏感性分析以评估结果的稳健性和时间顺序。

研究结果

风险因素的个体与联合效应

与既往研究一致，在Ausimmune和EIMS研究中，IM病史、高抗EBNA IgG滴度、低季节调整后血清25(OH)D水平（<50 nmol/L）、低发病前阳光暴露以及HLA-DRB1 * 1501风险等位基因均与MS风险显著相关。此外，研究证实了风险因素之间存在交互作用。例如，抗EBNA IgG滴度与HLA-DRB1 * 1501之间存在超加性交互作用。在Ausimmune研究中，还发现了抗EBNA IgG滴度与夏季/冬季低日照之间存在显著的正相加交互作用，同时暴露于两种风险因素的个体MS风险比无任何风险因素者高出近4倍。在乘性尺度上，较低的25(OH)D水平增强了EBV的不利效应。

DNAm模块的构建与关联

在Ausimmune研究中，通过EWAS和WGCNA构建了5个与MS风险显著相关的DNAm模块（A1-A5）。其中，排名前两位的A1和A2模块与关键风险因素（EBV指标、维生素D/日照） consistently 相关，因此被选作进一步中介分析的重点。在EIMS研究中，通过sPLS-DA得到了2个与MS风险显著相关的成分（E1和E2）。FCD与访谈的时间间隔与Ausimmune中的任何模块均无关，且在排除疾病修饰治疗（DMT）使用者或仅限于FDE病例的敏感性分析中，这些关联仍然存在。

在仅包含对照的分析中，Ausimmune的风险因素与DNAm模块的关联依然明显，且部分关联受HLA-DRB1 * 1501基因型修饰。这表明即使在没有MS的个体中，环境因素也与关键的DNAm模块相关。此外，A1和A2模块中的基因显著富集了全基因组关联研究（GWAS）中确定的MS风险基因，支持了相关的表观遗传改变是临床发病的上游原因而非后果的解读。

DNAm模块的中介作用

中介分析显示，DNAm模块显著介导了多种风险因素与MS风险的关联。

在Ausimmune研究中：

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  A1模块介导了抗EBNA IgG滴度（中介比例38%）、低25(OH)D（44%）和HLA-DRB1 * 1501（29%）与MS风险的关联。
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  A2模块介导了低25(OH)D（38%）、低夏季日照（47%）和HLA-DRB1 * 1501（21%）与MS风险的关联。
  在EIMS研究中：
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  E1模块介导了抗EBNA IgG滴度（39%）和HLA-DRB1 * 1501（49%）与MS风险的关联，对低25(OH)D的中介作用接近显著性（25%）。
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  E2模块介导了低25(OH)D（25%）和HLA-DRB1 * 1501（53%）与MS风险的关联。
  这些中介效应在排除DMT治疗者、限制于早期病例（如EIMS中诊断≤5年）或应用逆概率加权（IPW）后的敏感性分析中均保持稳健。反向中介分析（MS状态→DNAm模块→风险因素）未发现达到5%显著性水平的中介效应，排除了反向因果关系作为主要解释的可能性。

DNAm模块的生物学特征与跨研究一致性

通路富集分析揭示了中介性DNAm模块涉及的关键生物学通路。

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  Ausimmune的A1模块（436个CpGs，407个基因）最富集的Reactome通路包括“SCF-KIT信号传导”、“NOTCH1信号传导”、“细胞间信号传导”和“吞噬作用”。
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  A2模块（687个CpGs，627个基因）最富集的通路包括“SUMO E3连接酶SUMO化靶蛋白”、“信号转导”和“感染反应”。
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  EIMS的E1模块（1000个CpGs，795个基因）富集的关键通路包括“RAC1 GTP酶循环”、“SUMO化”、“血小板活化”和“干扰素信号传导”。
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  E2模块（400个CpGs，300个基因）富集的关键通路包括“CD3和T细胞受体信号传导”、“干扰素信号传导”、“MHC I类抗原呈递”和“转录调控”。

重要的是，DNAm模块的富集通路在两项研究中表现出高度一致性。在Ausimmune DNAm模块中富集的Reactome通路，有44.7%也在至少一个EIMS模块中富集，这比偶然预期高出4.82倍。在所有4个模块中均富集的通路包括“干扰素α/β信号传导”和“干扰素信号传导”等与MS密切相关的通路。

上游转录因子分析显示，Ausimmune的A1和A2模块排名前20的转录因子中，分别有45%和35%已被注释与MS相关。例如，与干扰素-β相关的转录因子IFNAR1和IFNAR2，通过JAK-STAT通路与A2模块的关键转录因子STAT4和IRF5相联系。

讨论

本研究提供了强有力的证据，表明EBV指标（IM病史、高抗EBNA IgG）、低维生素D状态、低日照暴露和HLA-DRB1 * 1501风险等位基因不仅单独而且协同作用，通过共同的差异DNAm表观遗传通路影响MS发病风险。这符合Rothman的“充分病因组成成分”理论，即识别出疾病通路中的一个组成原因后，作用于同一通路上的其他风险因素更容易被识别。例如，先前证实的HLA-DRB1 * 1501与高抗EBV IgG滴度之间的基因-环境交互作用，部分解释为两者均通过涉及MHC II类、NOTCH和GTP酶信号通路的表观遗传改变发挥作用。

本研究发现的富集通路具有明确的生物学合理性。RAC1 GTP酶循环、NOTCH信号传导、干扰素信号传导等通路在免疫细胞和CNS的功能调控中起核心作用，并且与EBV感染、维生素D状态等风险因素存在已知相互作用。跨研究的高度一致性（近半数Ausimmune富集通路在EIMS中复制）显著增强了研究结果的可靠性。

研究的优势包括两项病例对照研究的全面数据、使用网络级方法增强统计效力、以及进行的多种敏感性分析支持了时间顺序和结果的稳健性。局限性包括样本量中等、使用全血DNAm而非细胞类型特异性分析、以及病例对照设计本身对因果推断的固有局限。未来需要在大型前瞻性队列中进一步验证这些发现。

结论与展望

综上所述，本研究证实具有共同生物学基础的DNAm模块显著介导了MS经典环境和遗传风险因素与发病的关联。这些发现证实了这些多风险因素在MS病因学中的重要作用，并表明它们部分通过对相关生物通路（如干扰素信号、B细胞受体信号）中基因的差异甲基化发挥作用。重要的是，EBV感染及相关宿主反应与低血清25(OH)D、低日照和HLA-DRB1 * 1501风险等位基因共享共同的表观遗传通路来影响MS风险。这些发现可能为基于表观遗传的风险分层、预后判断以及未来针对这些通路的新型疗法（如DNA甲基化抑制剂）的开发提供信息。