基于MIRA-LFD技术的猪流行性腹泻病毒（PEDV）与A型猪轮状病毒（PoRVA）现场快速检测新策略

《Journal of Microbiological Methods》：Multienzyme isothermal rapid amplification (MIRA)-LFD assay for rapid detection of PEDV and PoRVA

本研究针对猪流行性腹泻病毒（PEDV）和A型猪轮状病毒（PoRVA）现场检测技术存在的灵敏度低、耗时长、依赖专业设备等问题，开发了一种整合逆转录-多酶等温快速扩增（RT-MIRA）与侧流层析试纸条（LFD）的现场检测平台。该技术可在30分钟内实现PEDV（20 copies/μL）和PoRVA（4.5 copies/μL）的高灵敏特异性检测，与RT-qPCR一致性达98%以上，为猪病毒性腹泻的早期诊断与防控提供了技术支撑。

　　

在规模化养猪场中，新生仔猪病毒性腹泻一直是制约生产效益的关键问题。其中，猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）和A型猪轮状病毒（Porcine rotavirus A, PoRVA）是引起仔猪腹泻、脱水和死亡的主要病原体，给全球养猪业造成巨大经济损失。传统检测方法如病毒分离、ELISA（酶联免疫吸附试验）和PCR（聚合酶链反应）虽有一定效果，但仍存在明显局限：耗时长、需要精密仪器、操作复杂，难以在养殖场现场快速应用。因此，开发一种灵敏、快速且便于现场实施的检测技术成为当前疫病防控的迫切需求。

针对这一挑战，Yicong Fan、Jianxin Wang等研究人员在《Journal of Microbiological Methods》上发表了一项创新研究，他们建立了一种名为RT-MIRA-LFD的检测平台，该技术结合了逆转录-多酶等温快速扩增（Reverse Transcription-Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, RT-MIRA）和侧流层析试纸条（Lateral Flow Dipstick, LFD）两种方法，实现了对PEDV和PoRVA的快速、高灵敏和可视化检测。

本研究主要采用以下关键技术：针对PEDV N基因和PoRVA VP6基因保守区域设计特异性引物，并进行5′端修饰（6-FAM和生物素标记）；通过RT-MIRA进行等温核酸扩增，无需复杂热循环设备；利用LFD实现扩增产物的可视化判读；使用临床采集的50份肛拭子样本进行验证，并以RT-qPCR（实时荧光定量逆转录聚合酶链反应）作为金标准进行对比评价。

研究结果分为三个主要部分：

一、引物设计与检测平台构建

研究人员针对PEDV N基因和PoRVA VP6基因的保守序列设计了正向和反向引物，并在5′端分别标记6-FAM和生物素。这一设计使得扩增产物能够与LFD试纸条上的抗体结合，实现一步法可视化检测。

二、灵敏度与特异性分析

灵敏度实验表明，该检测方法对质粒标准品的检测下限达到PEDV 20 copies/μL、PoRVA 4.5 copies/μL。在特异性方面，该 assay 与TGEV（猪传染性胃肠炎病毒）、PDCoV（猪δ冠状病毒）、CSFV（猪瘟病毒）等常见猪病原体无交叉反应，显示出良好的靶向识别能力。

三、临床样本验证

通过对50份临床肛拭子样本的检测，RT-MIRA-LFD与RT-qPCR的结果高度一致：PEDV检测符合率为98%，Kappa值为0.92；PoRVA检测符合率为96%，Kappa值为0.96。整个检测流程可在30分钟内完成，无需复杂仪器，结果可直接通过试纸条条带肉眼判读。

研究结论表明，RT-MIRA-LFD技术是一种适合现场应用的快速诊断工具，能够显著提升PEDV和PoRVA的检测效率，特别适用于资源有限的养猪场和基层兽医单位。该技术为病毒性腹泻的早期诊断、疫情监测和精准防控提供了实用化解决方案，有助于降低养猪业因疫病导致的经济损失。

讨论部分进一步强调，该方法不仅操作简便、检测快速，而且具备较高的灵敏度和特异性，其可视化结果判读降低了技术使用门槛。未来可进一步拓展该平台用于其他猪病原体的多重检测，从而更全面地保障生猪健康与养殖安全。