利用患者来源类器官模型揭示Ceritinib通过抑制PI3K-Akt信号通路和Nur77转录活性治疗ACTH垂体神经内分泌肿瘤的新机制

本研究针对ACTH分泌型垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs/库欣病)缺乏有效药物治疗的临床难题，通过建立患者来源类器官(PDO)模型筛选酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，发现Ceritinib能显著抑制肿瘤生长和ACTH合成。机制研究表明其通过靶向IGF1R/INSR-PI3K-Akt信号通路，关键介导分子Akt1通过调控Nur77转录因子影响POMC表达。该研究为库欣病的靶向治疗提供了新策略，并展示了PDO模型在罕见病研究中的重要价值。

　　

在神经内分泌肿瘤研究领域，ACTH分泌型垂体神经内分泌肿瘤（ACTH-secreting pituitary neuroendocrine tumors, PitNETs）——即临床熟知的库欣病（Cushing’s disease, CD），始终是困扰医学界的难题。这种罕见疾病不仅发病率低（欧洲每年百万人中仅1.2-2.4例，美国为6.2-7.6例），更因异常升高的皮质醇水平导致患者出现代谢紊乱、多器官功能障碍等一系列严重症状，生活质量显著下降（QoL = 56 ± 20），标准化死亡率更是普通人群的3.1倍。目前一线治疗手段经蝶窦手术虽有一定效果，但存在垂体功能减退、尿崩症、脑脊液漏等并发症风险，且复发率在不同医疗中心间差异显著（<5%至>25%）。更令人担忧的是，目前尚无针对CD的一线药物治疗方案，现有药物主要侧重于抑制激素合成或功能以缓解症状，无法从根本上解决肿瘤问题，患者需要长期接受治疗。

研究进展缓慢的关键瓶颈在于缺乏合适的临床前研究模型。传统体外模型如小鼠ACTH分泌肿瘤细胞系（AtT-20等）无法准确反映人类细胞特性，而原代人类垂体肿瘤细胞又难以传代且表型不稳定。正是在这样的背景下，患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）技术为突破这一困境带来了希望。这种通过三维体外培养人类PitNETs组织建立的多细胞结构，不仅保留了原始肿瘤的克隆异性和遗传特征，还能维持ACTH分泌功能长达四个月，极大地提高了实验结果的可靠性。

在这项发表于《Pharmacological Research》的研究中，南方医科大学南方医院神经外科团队通过对29例PitNETs组织样本（包括9例TPIT阳性、13例PIT-1阳性、4例SF-1阳性和3例混合类型）进行培养方法优化，建立了稳定的PDO模型。研究人员比较了基质胶滴注法和两步悬浮培养法，发现后者在保持生长速率的同时能增强ACTH分泌功能。利用这一优化模型，他们系统筛选了33种酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），发现Ceritinib在不同患者来源的PDOs体外和小鼠异种移植模型中均表现出显著且一致的疗效。

关键技术方法包括：从经蝶窦手术获取的PitNETs组织样本中建立PDO模型；采用免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)进行组织学验证；通过RNA测序和数据非依赖采集蛋白质组学(DIA)进行多组学分析；使用细胞活力检测(CCK-8)和细胞毒性检测(CellTiter-Glo)评估药物效应；通过蛋白质免疫印迹(WB)和酶联免疫吸附(ELISA)分析信号通路和激素水平；利用siRNA敲低和双荧光素酶报告基因实验验证机制。

研究结果方面：

在"3.1.培养方法影响PDOs的激素分泌功能"中，研究人员发现两步悬浮培养法能使PDOs表现出更强的ACTH分泌能力，峰值出现在培养72小时，且分泌的IGF-1、GH和PRL水平与患者实验室检测趋势高度一致。

在"3.2.PDOs重现PitNETs的组织学和分子特征"中，组织学和免疫组化分析证实PDOs能重现肿瘤组织的干性（CD44标志）、侵袭性（Ki67标志）以及其他垂体分化标志物（NeuroD1和ASCL1）的表达模式。转录组和蛋白质组测序进一步显示肿瘤组织与其来源的PDOs在分子水平上具有高度同质性。

在"3.3.Ceritinib抑制ACTH-PitNET PDOs生长和ACTH合成"中，药物筛选发现Ceritinib在AtT20细胞和PDOs中均表现出最强的抑制效果，平均IC₅₀值最低且在不同患者来源的PDOs中效果最稳定。在3μM浓度下就能显著抑制PDOs生长，10μM浓度下几乎完全溶解PDOs。重要的是，Ceritinib在抑制增殖的同时还能有效抑制ACTH分泌，且这种抑制作用与增殖抑制效果相对独立。

在"3.4.Ceritinib在体内抑制肿瘤生长和ACTH产生"中，小鼠模型实验证实Ceritinib（5mg/kg和10mg/kg剂量）能显著减弱肿瘤生长，诱导肿瘤细胞死亡和组织损伤。治疗组血浆ACTH水平显著降低，伴随毛发状况改善和CD相关病理表现（肾上腺肥大、脾萎缩、骨骼肌萎缩等）的缓解。骨保护素(OPG)表达水平的变化表明Ceritinib还能正常化骨代谢。

在"3.5.Ceritinib通过抑制PI3K-Akt通路磷酸化抑制肿瘤生长和ACTH，Akt1是关键介导因子"中，机制研究表明Ceritinib的疗效不依赖于ALK表达，而是通过靶向IGF1R和INSR发挥作用。多组学分析和KEGG富集分析发现PI3K-Akt信号通路是关键作用通路。Ceritinib显著抑制PI3K（p-p85亚基）和Akt（p-Akt）的磷酸化，降低PIP3水平。Akt1被确定为关键介导因子，其敲低减弱了Ceritinib对肿瘤生长和ACTH合成的抑制效果。进一步研究发现Ceritinib通过抑制Akt1活性，降低Nur77转录因子对POMC启动子区域（NBRE元件）的结合能力，从而抑制POMC转录和ACTH合成。

研究结论与讨论部分强调，这项研究通过建立优化的PDO模型，为ACTH-PitNETs研究提供了强有力的工具平台。Ceritinib作为治疗CD的潜在药物，通过靶向IGF1R/INSR-PI3K-Akt信号通路，同时抑制肿瘤生长和ACTH合成，实现了对疾病的"双管齐下"治疗。Akt1作为关键介导因子，通过调控Nur77转录活性影响POMC表达的机制为理解ACTH合成的调控提供了新视角。与目前临床主要使用的生长抑素受体配体帕瑞肽相比，Ceritinib作为口服制剂具有更好的患者依从性，且可能避免帕瑞肽常见的高血糖副作用，为CD患者提供了新的治疗选择。尽管研究存在样本量有限、未考虑性别差异等局限性，但这项工作为开发针对ACTH-PitNETs的靶向治疗策略奠定了坚实基础，展示了PDO模型在罕见病研究和药物开发中的重要价值。