ALKBH3-AS1通过YTHDF2介导SMAD3降解调控Th17细胞分化：揭示系统性红斑狼疮发病新机制

本研究针对系统性红斑狼疮（SLE）及狼疮性肾炎（LN）中Th17细胞异常分化的表观遗传调控机制不明的问题，揭示了长链非编码RNA ALKBH3-AS1的关键作用。研究人员发现ALKBH3-AS1可作为分子支架，招募m6A阅读器蛋白YTHDF2促进SMAD3 mRNA降解，从而抑制TGF-β/SMAD信号通路和Th17细胞分化。该研究不仅阐明了ALKBH3-AS1/YTHDF2/SMAD3轴在SLE发病中的新机制，还为SLE/LN的诊疗提供了新的潜在靶点。

　　

在自身免疫疾病的广阔研究领域中，系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）及其严重并发症狼疮性肾炎（Lupus Nephritis, LN）始终是困扰医学界的难题。尽管已知辅助性T细胞17（T Helper 17 Cell, Th17）及其分泌的白细胞介素-17A（Interleukin-17A, IL-17A）是驱动SLE和LN病理进程的关键因素，但针对这些分子的治疗突破却迟迟未能实现，疾病死亡率居高不下，凸显了探寻新治疗靶点的紧迫性。近年来，髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）被发现在自身免疫中扮演着复杂角色，它们能促进Th17细胞分化，然而其背后的表观遗传调控机制，特别是长链非编码RNA（Long Non-coding RNA, lncRNA）如何参与其中，仍是一个未被充分探索的领域。

为了解决这一科学难题，来自吉林大学第一医院乐群院区中心实验室的张艳利、甄宇、马占川等研究人员开展了一项深入的研究，其成果发表在《Pharmacological Research》上。他们的研究聚焦于一个名为ALKBH3反义RNA1（ALKBH3-AS1）的lncRNA，旨在揭示其在MDSC介导的Th17细胞分化以及SLE/LN发病过程中的作用与机制。

为了回答上述问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究纳定了临床样本队列，包括从吉林大学第一医院招募的SLE患者和健康对照者的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）。在实验模型方面，研究使用了 pristine诱导的SLE小鼠模型，并通过腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）载体进行基因操作。核心实验技术包括：微阵列芯片用于筛选差异表达的lncRNA；流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）用于分析细胞表型和细胞内信号分子（如pSMAD2/3）；定量实时聚合酶链反应（Quantitative Real-Time PCR, q-PCR）和蛋白质印迹（Western Blotting）用于检测基因和蛋白表达；体外Th17细胞极化培养体系用于功能验证；RNA荧光原位杂交（RNA-Fluorescence In Situ Hybridization, RNA-FISH）用于确定ALKBH3-AS1的亚细胞定位；RNA Pull-down和RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP） assays用于验证RNA与蛋白质（YTHDF2）以及RNA与RNA（SMAD3 mRNA）之间的相互作用；双荧光素酶报告基因实验和mRNA稳定性分析用于探讨ALKBH3-AS1对SMAD3转录后调控的作用。

3.1. ALKBH3-AS1与SLE进展及Th17细胞比例呈负相关

研究人员首先通过微阵列分析，比较了不同培养条件下（单纯 na?ve T细胞、na?ve T细胞与MDSCs共培养、共培养体系中加入Arg-1抑制剂nor-NOHA）人 na?ve CD4⁺ T细胞的lncRNA表达谱。他们发现，与MDSCs共培养会显著抑制ALKBH3-AS1的表达，而这种抑制可被Arg-1抑制剂逆转。临床数据分析显示，SLE患者PBMCs中ALKBH3-AS1的水平显著低于健康对照，且其表达量与SLEDAI评分呈负相关。更重要的是，ALKBH3-AS1的表达与IL-17A水平和Th17细胞比例也呈显著负相关。这些结果提示ALKBH3-AS1可能是一个与SLE疾病严重程度和Th17细胞异常分化相关的保护性因子。

3.2. ALKBH3-AS1/Alkbh3os1抑制Th17细胞分化

为了验证ALKBH3-AS1的功能，研究团队在人和小鼠的 na?ve CD4⁺ T细胞中分别过表达和敲低ALKBH3-AS1或其小鼠同源物Alkbh3os1。结果表明，过表达ALKBH3-AS1/Alkbh3os1能显著抑制Th17细胞分化关键标志物IL-17A和RORγt（Retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma-t）在mRNA和蛋白水平的表达；反之，敲低该lncRNA则促进Th17细胞分化。这直接证明了ALKBH3-AS1/Alkbh3os1在体外具有抑制Th17细胞分化的能力。

3.3. ALKBH3-AS1/Alkbh3os1通过TGF-β/SMAD3信号通路调控Th17细胞极化

接下来，研究人员探讨了ALKBH3-AS1的作用机制。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）提示TGF-β信号通路可能参与其中。已知TGF-β1能磷酸化SMAD2/3，进而与SMAD4形成复合物入核，与RORγt结合促进Th17分化。流式细胞术检测发现，过表达ALKBH3-AS1/Alkbh3os1降低了磷酸化SMAD2/3（pSMAD2/3）的水平，但不影响总SMAD2/3（tSMAD2/3）的量，导致pSMAD2/3与tSMAD2/3的比值下降；敲低则呈现相反效果。这表明ALKBH3-AS1是通过抑制TGF-β/SMAD信号通路来发挥其对Th17分化的抑制作用。

3.4. ALKBH3-AS1通过促进SMAD3的衰败来抑制TGF-β/SMAD信号

机制探索进一步深入。GSEA分析还显示SMAD蛋白复合物组装过程富集。由于ALKBH3-AS1在细胞核和细胞质中均有分布，而SMAD复合物组装始于胞质，研究人员推测ALKBH3-AS1可能在胞质调控SMAD稳定性。果然，他们发现过表达ALKBH3-AS1会选择性地降低SMAD3的mRNA和蛋白水平，而对SMAD2和SMAD4无影响。mRNA稳定性实验证实，ALKBH3-AS1过表达促进了SMAD3 mRNA的降解，缩短其半衰期。挽救实验表明，同时过表达SMAD3可以逆转ALKBH3-AS1过表达所导致的Th17分化抑制和TGF-β/SMAD信号抑制。这确定了SMAD3是ALKBH3-AS1下游的关键效应分子。

3.5. ALKBH3-AS1作为支架促进YTHDF2蛋白与SMAD3 mRNA的结合

那么，ALKBH3-AS1是如何促进SMAD3 mRNA降解的呢？RNA Pull-down联合质谱分析筛选出与ALKBH3-AS1结合的蛋白质，其中m6A阅读器蛋白YTHDF2（YTH N6-Methyladenosine RNA Binding Protein F2）因位于胞质、与ALKBH3-AS1结合力强且GSEA显示其与SMAD结合相关而被选中。后续的RNA Pull-down和RIP实验均证实ALKBH3-AS1能直接与YTHDF2蛋白结合。更重要的是，RIP实验发现，在过表达ALKBH3-AS1的细胞中，YTHDF2抗体富集到的SMAD3 mRNA显著增加，表明ALKBH3-AS1充当了“分子支架”，促进了YTHDF2与SMAD3 mRNA的结合。功能上，敲低YTHDF2可以部分逆转ALKBH3-AS1过表达导致的SMAD3 mRNA稳定性下降、SMAD3表达降低、TGF-β/SMAD信号抑制以及Th17分化抑制。此外，研究还确认MDSCs产生的Arg-1（而非其代谢产物鸟氨酸）是ALKBH3-AS1的上游调控因子，并且ALKBH3-AS1过表达能提高Jurkat细胞中整体的m6A修饰水平。

3.6. Alkbh3os1过表达减轻小鼠LN模型的组织炎症和疾病进展

最后，研究团队在动物水平验证了Alkbh3os1的治疗潜力。他们在pristane诱导的SLE小鼠模型中，通过腹腔注射携带Alkbh3os1的AAV-DJ病毒，实现其在肾脏、PBMCs和脾脏中的过表达。结果显示，与空载体对照组相比，Alkbh3os1过表达显著减轻了小鼠的蛋白尿、脱发和肾脏病理损伤。同时，小鼠肾脏、PBMCs和脾脏中Th17细胞的比例下降，TGF-β/SMAD信号通路活性也被抑制。这有力地证明了靶向提升Alkbh3os1表达能够缓解LN的疾病进程。

4. 讨论与结论

本研究通过临床观察、体外实验和动物模型，系统地阐明了lncRNA ALKBH3-AS1在SLE/LN发病中的保护作用及分子机制。其主要结论和重要意义归纳如下：

首先，研究首次发现并证实ALKBH3-AS1是MDSC来源的Arg-1信号通路的一个关键下游效应分子，其在SLE患者中低表达，且与疾病活动度和Th17细胞水平负相关，提示其可作为SLE潜在的诊断生物标志物。

其次，研究揭示了ALKBH3-AS1功能性的小鼠同源物Alkbh3os1，解决了lncRNA跨物种保守性差的翻译难题，为临床前研究提供了重要工具。

第三，也是最重要的机制突破，是发现ALKBH3-AS1在细胞质中作为分子支架，招募m6A阅读器YTHDF2，进而促进SMAD3 mRNA的降解。这一“ALKBH3-AS1/YTHDF2/SMAD3”调控轴，通过抑制关键的TGF-β/SMAD信号通路，从而遏制Th17细胞的分化。这不仅深化了对Th17细胞分化表观遗传调控的理解，也揭示了m6A修饰在自身免疫疾病中的新颖作用模式。

最后，动物实验证实，过表达Alkbh3os1能有效改善LN模型的肾脏病理和临床症状，这为开发以ALKBH3-AS1为靶点的SLE/LN新疗法（如基于AAV的基因治疗或小分子激动剂）提供了坚实的临床前依据。

综上所述，该项研究成功解析了一条由Arg-1/ALKBH3-AS1/YTHDF2/SMAD3构成的、调控Th17细胞分化的新型表观遗传通路，为理解SLE/LN的发病机制提供了全新视角，并指明了潜在的治疗新策略。