LncRNA-CFTBS通过miR-515-5p/miR-519e-5p/SAT1轴调控铁死亡以增强结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活的机制研究

本研究揭示了长链非编码RNA CFTBS (lncRNA-CFTBS) 在结核分枝杆菌 (M.tb) 感染中的新机制。该lncRNA通过竞争性结合miR-515-5p和miR-519e-5p，解除其对下游靶基因SAT1的抑制，进而激活非经典的铁死亡 (ferroptosis) 通路（涉及ALOX15而非GPX4轴），最终增强M.tb在巨噬细胞内的存活。这项工作为理解非编码RNA在结核病 (TB) 发病中的作用提供了新视角，并指出了潜在的治疗靶点。

　　

LncRNA-CFTBS增强BCG在巨噬细胞中的存活

研究首先通过前期转录组测序发现，在结核分枝杆菌 (M.tb) H37Rv感染THP-1来源的巨噬细胞后，一个名为lncRNA-CFTBS（全称lncRNA-cytoplasm-regulating ferroptosis and tuberculosis survival）的长链非编码RNA表达显著上调。通过核质分离和RNA荧光原位杂交 (FISH) 实验证实，lncRNA-CFTBS主要定位于细胞质中。随着BCG（卡介苗，M.tb减毒株）感染复数 (MOI) 的增加和感染时间的延长，lncRNA-CFTBS的表达水平持续上升。

为了探究其功能，研究人员构建了稳定过表达lncRNA-CFTBS (OE-Lnc-CFTBS) 和敲低lncRNA-CFTBS (sh-Lnc-CFTBS) 的THP-1细胞系。通过菌落形成单位 (CFU) 实验评估BCG的胞内存活情况，结果显示，过表达lncRNA-CFTBS显著促进了BCG在巨噬细胞内的存活，而敲低lncRNA-CFTBS则显著抑制了BCG的存活。这一现象在感染后24小时和48小时尤为明显。使用小干扰RNA (siRNA) 瞬时敲低lncRNA-CFTBS也得到了类似的结果，进一步验证了其功能。

LncRNA-CFTBS介导M.tb感染中的铁死亡

为了阐明lncRNA-CFTBS影响BCG存活的机制，研究使用了不同细胞死亡途径的抑制剂进行处理，包括自噬抑制剂氯喹 (CQ)、凋亡抑制剂Z-VAD、坏死性凋亡抑制剂Nec-1以及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 (Fer-1)。CFU实验结果表明，只有Fer-1能够消除OE-Lnc-CFTBS细胞与对照THP-1细胞在BCG存活率上的差异，提示lncRNA-CFTBS的作用与铁死亡通路密切相关。

铁死亡是一种铁依赖性的、以脂质过氧化物累积为特征的调节性细胞死亡形式。研究人员检测了一系列铁死亡相关指标。发现BCG感染本身就能诱导THP-1细胞发生铁死亡，表现为丙二醛 (MDA) 水平升高和透射电子显微镜 (TEM) 下观察到的线粒体形态异常（如线粒体缩小、嵴减少或消失），而Fer-1处理可逆转这些变化。

在OE-Lnc-CFTBS细胞中，BCG感染后细胞内亚铁离子 (Fe²⁺) 含量、活性氧 (ROS) 水平和MDA含量均显著高于对照组细胞；而在sh-Lnc-CFTBS细胞中，这些指标则显著降低。TEM观察进一步证实，过表达lncRNA-CFTBS加剧了BCG感染引起的线粒体损伤，而敲低lncRNA-CFTBS则减轻了损伤。

随后，通过蛋白质印迹 (Western Blot) 分析了铁死亡关键蛋白的表达。结果显示，过表达lncRNA-CFTBS导致铁蛋白重链1 (FTH1) 表达下降，花生四烯酸15-脂氧合酶 (ALOX15) 表达上升，而对溶质载体家族7成员11 (SLC7A11) 和谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4) 的表达没有显著影响。这表明lncRNA-CFTBS主要是通过影响铁代谢（FTH1）和脂质过氧化（ALOX15）通路来调控铁死亡，而非经典的胱氨酸/GSH/GPX4轴。

LncRNA-CFTBS通过miR-515-5p/miR-519e-5p-SAT1轴调控M.tb感染过程中的铁死亡

鉴于lncRNA-CFTBS定位于细胞质，研究者推测其可能作为竞争性内源RNA (ceRNA) 吸附微小RNA (miRNA) 发挥作用。通过生物信息学数据库 (RNA22, miRDB) 预测与lncRNA-CFTBS结合的miRNA，并结合前期转录组数据中在M.tb感染下表达上调且与铁死亡（非GPX4通路）相关的基因进行筛选，发现精脒/精胺N1-乙酰转移酶1 (SAT1) 是一个关键节点。进一步筛选能同时靶向SAT1并与lncRNA-CFTBS存在潜在结合位点的miRNA，最终锁定miR-515-5p和miR-519e-5p。

实验证实，在BCG或H37Rv感染后，SAT1的mRNA和蛋白水平随时间推移和MOI增加而显著上调。相反，miR-515-5p和miR-519e-5p的表达则在感染后显著下调。

双荧光素酶报告基因实验验证了分子间的直接相互作用。将含有野生型 (WT) 或突变型 (MUT) miR-515-5p/miR-519e-5p结合位点的lncRNA-CFTBS序列或SAT1的3‘非翻译区 (3’-UTR) 序列克隆至pmirGLO载体。结果发现，共转染miR-515-5p或miR-519e-5p mimics可显著抑制lncRNA-CFTBS-WT和SAT1-WT报告基因的荧光素酶活性，而对相应的突变体则无影响，证实了lncRNA-CFTBS与这两个miRNA的直接结合，以及这两个miRNA对SAT1的直接靶向调控。

在细胞水平上，过表达lncRNA-CFTBS会降低miR-515-5p和miR-519e-5p的水平，而敲低lncRNA-CFTBS则提高其水平。反之，过表达miR-515-5p或miR-519e-5p会降低SAT1的mRNA和蛋白表达，抑制这些miRNA则会上调SAT1表达。这些结果共同证实了lncRNA-CFTBS/miR-515-5p/miR-519e-5p/SAT1这一调控轴的存在。

miR-515-5p和miR-519e-5p通过铁死亡通路调控BCG的胞内存活

功能上，过表达miR-515-5p或miR-519e-5p显著抑制了BCG在巨噬细胞内的存活，而敲低这些miRNA则促进了BCG的存活。机制上，过表达这些miRNA降低了BCG感染后细胞内的Fe²⁺含量、ROS水平和MDA含量，并减轻了线粒体损伤；敲低这些miRNA则产生相反效应。蛋白质印迹分析显示，miR-515-5p/miR-519e-5p的调控主要影响FTH1和ALOX15蛋白水平，而不影响GPX4和SLC7A11，这与lncRNA-CFTBS的结果一致，进一步表明它们通过相同的非经典铁死亡通路发挥作用。

SAT1增强BCG的胞内存活

对SAT1本身的功能研究表明，过表达SAT1 (OE-SAT1) 促进BCG存活，而敲低SAT1 (sh-SAT1或用siRNA) 则抑制BCG存活，这在BCG和H37Rv感染模型中均得到验证。在OE-SAT1细胞中，BCG感染后Fe²⁺含量、ROS水平、MDA含量均升高，线粒体损伤加剧；sh-SAT1细胞则相反。蛋白质印迹再次确认SAT1过表达导致FTH1下调、ALOX15上调。

miR-515-5p/miR-519e-5p通过SAT1调控铁死亡

挽救实验进一步巩固了该调控轴。当共转染SAT1的小干扰RNA (si-SAT1) 和miR-515-5p/miR-519e-5p的mimics或inhibitor后，这些miRNA对铁死亡指标（Fe²⁺、ROS、MDA、线粒体形态）的调控效应被显著削弱或消除。这表明miR-515-5p/miR-519e-5p对铁死亡的调控依赖于SAT1。

LncRNA-CFTBS通过miR-515-5p/miR-519e-5p调控铁死亡

同样，在敲低lncRNA-CFTBS的基础上，再抑制miR-515-5p或miR-519e-5p，可以部分回撤因lncRNA-CFTBS敲低导致的铁死亡抑制表型，表现为Fe²⁺、ROS、MDA水平回升以及线粒体损伤加重。这证明lncRNA-CFTBS是通过吸附miR-515-5p/miR-519e-5p来解除其对SAT1的抑制，进而促进铁死亡。

讨论与结论

本研究深入探讨了lncRNA-CFTBS在M.tb感染中的新功能。其主要机制是：M.tb感染上调巨噬细胞中lncRNA-CFTBS的表达；高表达的lncRNA-CFTBS在细胞质中作为“分子海绵”竞争性结合miR-515-5p和miR-519e-5p，从而解除这两个miRNA对靶基因SAT1的翻译抑制；SAT1表达上调后，通过促进脂质过氧化（可能涉及ALOX15等）和影响铁代谢（如降低FTH1），驱动了非经典铁死亡通路的发生；这种特定的铁死亡过程改变了细胞内环境，最终有利于M.tb在巨噬细胞内的寄生和存活。

该研究不仅揭示了一个新的lncRNA-miRNA-mRNA调控轴在结核病发病机制中的作用，突出了非经典铁死亡通路的重要性，还为开发以lncRNA-CFTBS/miR-515-5p/miR-519e-5p/SAT1轴为靶点的结核病治疗新策略提供了理论依据。