基于MRI影像组学的间充质干细胞干预后结肠癌早期生物学进展预测模型研究

本研究创新性地将MRI影像组学（Radiomics）应用于间充质干细胞（MSCs）干预后的结肠癌 preclinical 模型，成功构建了可在早期（第7天）预测肿瘤进展的模型（AUC>0.8）。研究首次发现静脉注射MSCs在肿瘤形成初期具有促进进展的作用（表现为CD34+新生血管增加），证实了影像组学特征在探测肿瘤微环境（TME）微观变化方面优于传统体积测量，为干细胞疗法疗效与安全性的早期、无创评估提供了新策略。

　　

Abstract

背景

干细胞疗法是肿瘤治疗的潜在方法，但其疗效和安全性仍不完全可控。因此，在治疗后早期预测肿瘤进展并进行疗效评估，以指导及时调整治疗方案至关重要。影像组学近年来被广泛应用于评估肿瘤的行为和特征。本研究旨在探讨MRI影像组学对结肠癌干细胞干预早期治疗结果的预测价值。

方法

通过将CM38结肠癌细胞植入C57BL/6小鼠腹股沟区建立皮下肿瘤模型。在24小时内通过尾静脉静脉注射骨髓间充质干细胞（MSCs）。在第7天进行T1加权MRI扫描以提取影像组学特征，监测肿瘤生长，并通过免疫组织化学评估新生血管（CD34）和增殖（Ki67）。构建早期MRI影像组学模型以预测结肠癌进展。

结果

与对照组相比，干细胞干预组的肿瘤生长更快，尽管在早期未观察到显著的体积差异。共提取了1162个影像组学特征，筛选出17个强相关特征（包括纹理特征、一阶特征和形状特征）用于构建预测模型。最终模型在训练集和测试集上均表现出AUC > 0.8的性能。

结论

静脉注射MSCs促进了皮下植入的CM38结肠癌的进展。成功建立了基于MRI影像组学的预测模型，能够在干预后早期预测肿瘤进展。

引言

间充质干细胞（MSCs）具有肿瘤归巢特性，并通过调节免疫成分和抑制炎症反应来调节肿瘤微环境，从而发挥抗肿瘤作用。然而，MSCs的生物安全性需要重点关注。MSCs具有多向分化潜能，其致瘤风险仍在研究中。此外，MSCs分泌的旁分泌因子（如趋化因子、细胞因子和生长因子）可能促进肿瘤进展和转移。因此，MSCs疗法对于结直肠癌的疗效和安全性仍不确定，需要早期预测肿瘤进展以指导及时的治疗调整。

医学成像是肿瘤评估的基石，不仅能测量大小，还能表征瘤内特征（如坏死、出血和侵袭）。先进的MRI序列，如功能MRI（fMRI）和化学交换饱和转移（CEST），可提供肿瘤微环境内分子改变的信息。然而，这些细微差异在常规成像上通常难以察觉。影像组学通过高通量提取定量特征来检测微观结构变异，提供了解决方案。

最近的研究进展凸显了影像组学在无创肿瘤表征、基因分型和生存预测中的作用。尽管取得了这些进展，目前尚不清楚影像组学特征是否能在结肠癌模型中检测到MSC疗法引起的早期、亚临床的肿瘤促进作用。我们假设基于MRI的影像组学可以无创地捕捉到MSC诱导的肿瘤进展相关的早期生物学变化，例如新生血管增加，而这些变化在肿瘤体积变化显现之前就已发生。因此，基于MRI的影像组学可以作为一种非侵入性的早期治疗评估工具，尽可能早地识别恶性反应，为调整肿瘤治疗计划提供更多时间。本研究利用早期MRI影像组学特征来监测肿瘤进展并建立预测模型，旨在基于初始成像数据实现早期干预。

材料与方法

伦理声明

所有动物均购自湖南实验动物有限公司。动物实验经重庆大学附属中央医院重点实验室批准，并按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）概述的原则进行。

细胞

从购自湖南实验动物有限公司的1至7天龄新生小鼠中分离骨髓间充质干细胞（MSCs）。提取骨髓，培养48小时后（条件为37°C，5% CO₂和10%胎牛血清）通过去除未贴壁细胞获得贴壁细胞。将贴壁细胞扩增并传代至第3代（P3）用于后续实验。流式细胞术检测MSCs的表面标志物（CD29, CD44, CD11b, CD45）表达。将10⁶个CM38细胞（悬浮于100 μL磷酸盐缓冲盐水PBS中）注射到小鼠右腹股沟区，12小时后通过尾静脉静脉注射5 × 10⁵个P3 MSCs（悬浮于100μL磷酸盐缓冲盐水中）。60只小鼠被植入肿瘤，每只小鼠植入一个肿瘤。对照组注射100 μL PBS，干预组注射100 μL间充质干细胞悬液。每组30只小鼠。

成像

在肿瘤植入后第7天进行磁共振成像（MRI）。用异氟烷麻醉小鼠（诱导4–5%；维持1–2%），并使用3.0T MRI系统（Siemens MAGNETOM Prisma）和专用小动物线圈进行扫描。成像参数包括：TE 5.6 ms, TR 12.7 ms, FOV 64 mm × 64 mm, 层厚0.5 mm, 层间距1 mm。扫描期间通过用棉垫包裹小鼠来维持保温。

肿瘤生长

从植入后一周开始，每48小时记录一次肿瘤体积。每2天用卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积（V）= (1/2) × 长（L）× 宽（W）× 高（H）。当肿瘤最大直径达到15 mm–20 mm时，在麻醉下通过颈椎脱位法处死小鼠，并收集肿瘤组织用于后续分析。

苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学

将切除的肿瘤组织固定在4%磷酸盐缓冲福尔马林中，石蜡包埋，并连续切片成3 μm厚切片。进行HE染色用于组织学检查。进行免疫组织化学（IHC）以评估CD34和Ki67表达。使用ImageJ软件分析染色图像以量化表达率。采用独立样本t检验比较两组数据，P值 < 0.05被认为具有统计学意义。

影像组学特征提取

选择T1WI图像进行特征提取。所有感兴趣区域（ROIs）均使用统一成像智能一站式研究平台（uAI Research Portal）沿肿瘤边界勾画。两位具有10年以上经验的放射科医生在不知晓临床结果的情况下独立评估T1WI图像。从每个ROI自动提取影像组学特征，共提取1162个图像特征，包括形状特征、一阶特征和纹理特征。

特征选择与模型构建

使用随机种子20将数据分组进行5折交叉验证。在特征选择之前，使用Z-score标准化对所有提取的影像组学特征进行标准化。应用组内相关系数（ICC）分析检验两位放射科医生提取特征的一致性，选择ICC > 0.75的特征进行进一步分析。随后，使用K-best选择300个相关性最高的图像特征。最后，应用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）方法在训练集中选择最有效的特征。

在训练数据集上实施了六种不同的机器学习算法，包括高斯过程（GP）、逻辑回归（LR）、二次判别分析（QDA）、随机森林（RF）、随机梯度下降（RGD）和支持向量机（SVM）。对于每个模型，使用受试者工作特征（ROC）曲线和平均曲线下面积（AUC）来评估预测性能。

采用双向随机效应模型的组内相关系数（ICCs）评估ROI测量的一致性。使用LASSO统计构建预测治疗组的模型。通过5折交叉验证和交叉验证函数最小化来选择惩罚参数（λ）。采用独立样本t检验比较两组间的肿瘤体积。p < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

第三代间充质干细胞（MSCs）呈现梭形形态并贴壁生长。流式细胞术分析显示干细胞标志物CD29（90.6%）和CD44（93.5%）高阳性表达，而CD11b（92.6%）和CD45（99.7%）呈阴性表达。CM38细胞显示贴壁生长特性，细胞体积小，核质比高，细胞增殖密集。

术后第7天的MRI检查证实肿瘤生长，未见明显的皮肤隆起。一只对照组小鼠在首次MRI扫描后因低温死亡。所有剩余小鼠在9周内于植入部位形成肿瘤。第3周时，5个肿瘤（对照组2个；干预组3个）最大直径达到15 mm–20 mm。第4周时，28个肿瘤（对照组12个；干预组16个）。第5周时，20个肿瘤（对照组11个；干预组9个）。第7周时，2个肿瘤（对照组）。第10周时，1个肿瘤（对照组）。

额外死亡率包括：对照组2只小鼠分别在肿瘤植入后2周和3周无故死亡，肿瘤最大直径小于15 mm。可以看出，干预组的肿瘤生长速率快于对照组，这表明在肿瘤早期阶段尾静脉注射干细胞可以促进肿瘤生长。

植入后第1周，MRI显示两组间肿瘤体积无统计学显著差异（P = 0.21）。然而，当达到第一个肿瘤大小阈值时（第3周最大直径15mm-20 mm），MSC干预组的肿瘤体积（99.8 ± 45.9 mm3）显著大于对照组（72.0 ± 37.2 mm3, P < 0.05）。免疫组织化学分析显示，干预组的CD34表达率（3.05% ± 1.16%）高于对照组（2.72% ± 0.44%, P < 0.05），但Ki67表达水平无显著组间差异（干预组19.48% ± 7.02%，对照组26.81% ± 4.01%, P = 0.12）。这表明MSCs促进了肿瘤血管生成，但对肿瘤细胞增殖没有显著的促进作用。

影像组学分析显示，从成像数据中共提取了1,162个影像组学特征。通过严格的特征选择，确定了17个稳健的预测特征，包括：10个纹理特征、6个一阶特征和1个形状特征。成功构建了总共27个预测模型，所有模型在训练集和测试集中均表现出高判别性能，曲线下面积（AUC）均大于0.8。

讨论

本研究建立了一个预测框架，将早期MR影像组学特征与静脉间充质干细胞（MSCs）干预后皮下结肠癌模型的肿瘤进展联系起来。我们成功开发了27个稳健的模型，显示出强大的预测性能，在训练集和测试集中的曲线下面积（AUC）值均超过0.8，最优模型的AUC高达0.88。虽然肿瘤体积仍然是传统的治疗监测指标，但我们的研究发现在早期干预阶段没有显著的体积差异。这强调了影像组学在可测量的尺寸变化之前探测肿瘤形态前改变的能力，特别是瘤内异质性。值得注意的是，纹理特征在我们选定的高相关性特征中占主导地位。Dohan等人的研究同样表明，纹理分析可以在体积变化之前预测化疗反应，这与先前的证据一致，即影像组学纹理反映了肿瘤的复杂性。

CD34是与新生血管表达相关的因子。Kai-Hung Wang等人指出MSCs促进卵巢癌细胞增殖。Wang R等人的研究表明，MSCs在缺氧微环境中通过HIF-1α信号通路产生VEGF。相比之下，Tang RJ等人报道了MSCs在结肠炎相关癌症模型中通过Smad2/TGF-β介导的Treg分化发挥肿瘤抑制作用。这种差异可能源于我们的无菌皮下模型与炎症驱动的致癌模型之间的差异。骨髓间充质干细胞在肿瘤中的作用受各种生长因子、细胞因子和趋化因子的控制，这些因子影响细胞增殖、血管生成和转移。尽管已经进行了大量研究来探索间充质干细胞与癌细胞之间的相互作用，但间充质干细胞如何与癌细胞和肿瘤微环境进行通讯仍不清楚。需要进一步的研究来证实这一点。在我们的研究中，与MSCs的促肿瘤作用一致，我们的干预组与对照组相比表现出增强的CD34阳性新生血管形成。据推测，这些显著相关的影像组学特征可能与CD34表达存在一定相关性。

虽然术前MR影像组学已被验证可用于Ki-67预测，但我们观察到组间Ki-67表达无显著差异。这一无效结果可能反映了我们同基因肿瘤模型中有限的增殖异质性，与临床研究中肿瘤间的变异相比。此外，增值往往发生在血管生成之后，因此Ki67和CD34之间可能存在不匹配。这也可以解释为什么Ki67在组间保持不变而CD34增加。

尽管取得了预测成功，但我们的研究存在局限性。适中的样本量（n = 30）限制了影像组学的普适性，尽管这是基于动物使用最小化的伦理原则。为了减轻过拟合，我们实施了五折交叉验证，从而增强了模型在有限数据下的可靠性。本研究的另一个局限性是缺乏原位模型的复杂性，并且其仅识别了肿瘤进展促进作用，没有能力检测或预测肿瘤抑制反应。这一关键差距将在后续的实验验证中得到系统解决，以阐明干细胞干预的双重调节机制。

结论

在小鼠腹股沟皮下接种肿瘤细胞后12小时内通过尾静脉注射间充质干细胞，加速了肿瘤生长并增加了肿瘤中CD34的表达，表明间充质干细胞在肿瘤形成初期对肿瘤进展具有促进作用。此外，利用肿瘤形成早期阶段的磁共振成像影像组学分析预测肿瘤进展的模型AUC大于0.8，表明影像组学可以在肿瘤干预早期预测肿瘤进展。

利益冲突

本研究无竞争利益，因为无有偿雇佣、无专利申请，且无作者将从此研究中受益。

数据共享声明

数据可根据合理要求向通讯作者索取。