靶向PHD2/HIF-1α/HO-1通路：曲美他嗪在高血压肾病中的关键作用机制

本研究首次揭示抗缺血药物曲美他嗪（TMZ）通过调控PHD2/HIF-1α/HO-1信号轴改善高血压肾病（HN）的新机制。实验表明TMZ能下调PHD2、上调HIF-1α和HO-1表达，显著改善肾功能指标、减轻肾脏纤维化及炎症反应，为HN治疗提供了新的靶点策略。

　　

ABSTRACT

Objective

本研究旨在揭示曲美他嗪（TMZ）对小鼠高血压肾病（HN）的影响及其潜在机制。

Methods

将60只雄性129小鼠（8-10周龄）随机分为6组（每组n=10）：对照组、模型组、TMZ组、TMZ+si-PHD2组、TMZ+ZnPP（HO-1抑制剂）组和TMZ+KC7F2（HIF-1α抑制剂）组。除对照组外，其余各组均通过血管紧张素II（Ang II）诱导HN模型。TMZ灌胃给药28天，其他基于TMZ的组别额外给予si-PHD2、ZnPP或KC7F2。检测血压、肾功能、促炎细胞因子和肾脏病理学变化。通过RT-qPCR和Western blot分析PHD2、HO-1、HIF-1α和Collagen I的蛋白/mRNA水平。

Results

与对照组相比，模型组血压升高、肾损伤、纤维化以及PHD2、HIF-1α、HO-1、Collagen I和炎症标志物水平均显著增加（P < 0.05）。TMZ治疗减轻了肾损伤，并下调了PHD2，同时上调了HIF-1α和HO-1。这些效应在PHD2敲低（TMZ+si-PHD2）后进一步增强，但被HO-1或HIF-1α的抑制（TMZ+ZnPP, TMZ+KC7F2）所逆转。

Conclusion

TMZ通过调节PHD2/HIF-1α/HO-1通路改善小鼠HN。

Introduction

高血压肾病（HN）是慢性高血压继发的进行性肾脏疾病，是全球终末期肾病（ESRD）的主要原因。长期血压升高会导致肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化和炎症浸润，最终导致不可逆的肾功能障碍。尽管血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂等抗高血压疗法取得了进展，但一部分患者会出现严重的不良反应，且治疗益处仅限于有限的人群，这凸显了迫切需要针对肾损伤分子通路的新型治疗策略。

HN的发病机制涉及血流动力学应激、氧化应激、炎症和纤维化重塑之间的复杂相互作用。最近的研究强调了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在肾脏适应缺血和炎症损伤中的关键作用。在常氧条件下，脯氨酰羟化酶结构域蛋白2（PHD2）羟化HIF-1α，标记其用于蛋白酶体降解。然而，在缺氧或炎症微环境中，PHD2活性被抑制，稳定了HIF-1α，后者转录激活下游的细胞保护基因，如血红素氧合酶-1（HO-1）。HO-1通过将血红素降解为胆绿素、一氧化碳和游离铁，发挥抗氧化、抗炎和抗纤维化作用。矛盾的是，在慢性病理条件下，持续的HIF-1α激活可能会加剧纤维化，表明该通路在肾脏病理生理学中具有双重作用。

曲美他嗪（TMZ）是一种临床批准的抗缺血药物，其在心绞痛治疗之外已显示出多效性益处。该药物通过减少炎性细胞因子、减轻氧化应激以及维持氧和能量稳态来发挥肾脏保护作用。在药物性肾毒性和糖尿病肾病中，TMZ治疗通过灭活免疫细胞、减少肾纤维化、凋亡、炎症和组织学异常来预防肾损伤。先前的研究表明，在叶酸诱导的肾损伤和肾缺血再灌注模型中，TMZ通过上调HIF-1α/HO-1轴来减轻肾功能障碍。HO-1代谢产物一氧化碳（CO）通过抑制PHD2和增强热休克蛋白90（Hsp90）活性来稳定HIF-1α，形成正反馈环。然而，尚无研究探讨TMZ是否影响PHD2/HIF-1α/HO-1轴，该通路与肾脏保护和病理均有关。

本研究首次提出TMZ可能通过调节PHD2/HIF-1α/HO-1信号级联反应改善HN。使用血管紧张素II（Ang II）诱导的小鼠HN模型，我们旨在（1）评估TMZ对血压、肾功能、组织病理学和炎症的肾脏保护作用；（2）阐明PHD2、HIF-1α和HO-1在TMZ作用机制中的参与；（3）使用药理学和遗传学抑制剂验证该通路的治疗特异性。我们的发现可能为TMZ的肾脏保护特性提供机制见解，并将PHD2/HIF-1α/HO-1轴确定为HN的潜在治疗靶点。

Materials and methods

Ethics statement

本动物实验根据中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院机构动物护理和使用委员会批准的伦理指南进行。

Establishment of an animal model of HN

采购60只雄性129小鼠（SPF级，8-10周龄），并在实验室屏障系统中适应1周。将小鼠按随机数字表法分为6组：对照组、模型组、TMZ组、TMZ+si-PHD2组、TMZ+ZnPP（HO-1抑制剂）组和TMZ+KC7F2（HIF-1α抑制剂）组，每组10只。除对照组外，其余各组小鼠通过ALZET植入式微量渗透泵连续输注Ang II以建立HN模型。TMZ组每天灌胃给予TMZ（20 mg/kg/天，100 μL）。TMZ+si-PHD2组在Ang II输注和TMZ治疗基础上额外给予si-PHD2质粒。TMZ+ZnPP和TMZ+KC7F2组分别腹腔注射ZnPP（20 mg/kg/天，100 μL）和KC7F2（10 mg/kg），每周三次，同时在28天实验期间维持Ang II输注和TMZ给药。治疗期结束后，收集小鼠尿液和血液样本，并取出肾脏用于后续分析。

Sample collection and indicator measurement

建模后14天，使用小鼠无创血压计每天固定时间测量尾动脉血压。建模28天后，收集24小时尿液和血液样本。检测血肌酐、血尿素氮（BUN）和24小时尿蛋白水平。

ELISA

使用小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒检测各组小鼠血液中这些细胞因子的水平。

Hematoxylin–eosin (HE) staining

取小鼠肾组织制作石蜡切片，进行HE染色。使用倒置显微镜观察并拍照。参照经典的急性肾损伤模型评分系统（0-4分）对肾小管损伤进行评分。

Sirius Red staining

用天狼星红染料溶液对小鼠肾组织进行染色以评估肾纤维化程度。使用ImageJ软件分析图像并计算天狼星红染色阳性面积占总视野的比例。

Western blot

裂解肾组织，提取蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白并转膜。用抗PHD2、抗HIF-1α、抗HO-1、抗Collagen I和抗GAPDH一抗孵育过夜，然后与HRP标记的二抗孵育。使用成像系统检测信号，并用ImageJ进行光密度分析。

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)

使用TRIzol试剂从肾组织中提取总RNA，逆转录成cDNA。使用SYBR Green Master Mix在实时PCR系统上进行定量PCR。引物序列见表1。基因表达水平以GAPDH为内参，采用2^?ΔΔCt法进行分析。

Statistics

使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，实验数据以均值±标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验分析数据变异性，P < 0.05认为有统计学意义。

Results

Effect of TMZ on the activity of PHD2/HIF-1α/HO-1 pathway in kidney tissues of mice with HN

为了研究TMZ是否通过改变PHD2/HIF-1α/HO-1信号轴介导其对HN的保护作用。RT-qPCR和Western blot结果显示，与对照组相比，模型组中PHD2、HIF-1α和HO-1三个标志物的表达均上调。有趣的是，TMZ治疗导致PHD2蛋白水平降低，但进一步增加了HIF-1α和HO-1的表达。沉默PHD2后，PHD2在转录和蛋白水平上的表达进一步下降，同时伴随着HIF-1α和HO-1的持续增加。然而，在TMZ+ZnPP和TMZ+KC7F2组中，这种趋势被逆转，HIF-1α和HO-1的表达被明显抑制。

TMZ improves renal function via the PHD2/HIF-1α/HO-1 pathway in mice with HN

进一步探讨了TMZ通过激活PHD2/HIF-1α/HO-1通路对HN小鼠肾功能的改善作用。结果显示，与对照组相比，模型组血压、24小时尿蛋白、血肌酐和BUN水平升高，证实了肾功能障碍。TMZ治疗部分逆转了这些变化，并且在PHD2沉默（TMZ+si-PHD2组）后观察到进一步改善。相反，ZnPP和KC7F2联合治疗（TMZ+ZnPP和TMZ+KC7F2组）导致这些参数反弹，表明保护效应受损。

TMZ alleviates structural kidney damage in HN via modulation of the PHD2/HIF-1α/HO?1 pathway

此外，我们探讨了TMZ如何通过调节PHD2/HIF-1α/HO?1通路减轻HN的结构性肾损伤。HE染色显示，与对照组相比，模型组肾小管上皮细胞出现明显水肿、坏死和炎症浸润，肾小管损伤评分显著增加。与模型组相比，TMZ治疗降低了损伤评分，在TMZ+si-PHD2组中评分进一步降低，表明PHD2敲低增强了TMZ的肾脏保护作用。然而，与TMZ组相比，当联合使用HO-1抑制剂ZnPP或HIF-1α抑制剂KC7F2时，损伤评分增加，显示干预效果被显著抑制。

天狼星红染色的结果与结构评分一致：模型组肾间质纤维化面积增加。与模型组相比，TMZ组纤维化面积减少，TMZ+si-PHD2组进一步减少。然而，与TMZ组相比，ZnPP和KC7F2组的Collagen I蛋白水平升高。

Western blot分析显示，与对照组相比，模型组Collagen I蛋白表达增加。与模型组相比，TMZ组其表达降低，TMZ+si-PHD2组进一步降低。然而，与TMZ组相比，联合使用ZnPP或KC7F2使其表达增加至约1.8-1.9倍（$$P < 0.01 vs TMZ）。

这些数据一致支持TMZ可以减轻高血压肾病小鼠的肾脏结构损伤和纤维化。PHD2敲低能显著增强其效果，而抑制HIF-1α或HO-1则削弱了TMZ的保护作用，进一步证实了HIF-1α/HO-1通路在其肾脏保护作用中的关键角色。

TMZ diminishes inflammation via the PHD2/HIF-1α/HO-1 pathway in mice with HN

最后，我们验证了TMZ通过激活PHD2/HIF-1α/HO-1轴对减轻HN肾脏炎症的影响。ELISA分析表明，与对照组相比，模型组IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高。TMZ治疗降低了这些炎症标志物的水平，在TMZ+si-PHD2组中观察到进一步降低。然而，在TMZ+ZnPP和TMZ+KC7F2组中，细胞因子水平再次上升，表明抗炎作用被逆转。

Discussion

近年来，HN的全球患病率激增，已成为一个关键的公共卫生挑战。TMZ已被证明具有心脏保护和抗炎作用。临床试验报告了其在慢性肾病患者中的安全性，并改善了氧化应激标志物。在本研究中，我们证明TMZ通过调节PHD2/HIF-1α/HO-1通路减轻小鼠HN。这些效应背后的机制似乎与氧化应激、缺氧反应和炎症通路的调节密切相关。

本研究结果揭示了TMZ治疗小鼠肾纤维化减少，表现为Collagen I表达和天狼星红染色减少。肾纤维化是HN的一个关键病理特征，其特征是细胞外基质过度沉积和肌成纤维细胞活化。TMZ的抗纤维化作用可能是通过HO-1依赖性通路介导的。HO-1降解促纤维化的血红素衍生物并上调抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的表达，从而对抗氧化应激——这是胶原沉积的关键驱动因素。一致地，我们观察到TMZ治疗小鼠的Collagen I表达和天狼星红阳性纤维化区域减少，而这些效应被ZnPP逆转。此外，HIF-1α稳定可能直接抑制TGF-β信号传导，这是纤维化的主要调节因子，如在糖尿病肾病模型中所显示。

TMZ对冠状动脉和外周血管有扩张作用，可以增加血管生成并改善外周血管疾病。在我们研究中，TMZ的降压作用与其报告的血管舒张特性一致。TMZ增强内皮一氧化氮合酶活性，改善血管反应性并降低外周阻力。我们的数据通过将血压降低与PHD2/HIF-1α/HO-1调节联系起来扩展了这些发现。Huang等人先前的研究表明，血管平滑肌细胞中的HIF-1α激活抑制血管紧张素原表达，从而减弱Ang II介导的血管收缩。这一机制可能解释了TMZ+si-PHD2小鼠血压控制增强的原因，其中HIF-1α水平最大化升高。

Gupta等人报道，TMZ给药通过抑制氧化应激、炎症、线粒体功能障碍和组织学损伤显示出肾脏保护作用并减少肾功能障碍。在本研究中，TMZ的抗炎作用，如IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低所证明，可能源于HO-1介导的核因子κB（NF-κB）激活抑制。HO-1衍生的CO抑制NF-κB核转位，从而抑制促炎细胞因子的产生。这一机制与Mohamed等人进行的一项研究中探讨的机制一致。此外，我们的结果与先前的研究结果一致，表明TMZ通过抑制NLRP3炎性体激活来减轻缺血再灌注损伤中的心肌炎症，如Wang等人所报告。值得注意的是，TMZ+si-PHD2小鼠炎症标志物的进一步减少表明PHD2抑制通过放大的HIF-1α信号增强了HO-1的抗炎能力。

鉴于这些观察结果，我们验证了先前的假设：TMZ通过调节PHD2/HIF-1α/HO-1信号通路改善HN。根据现有研究，TMZ通过激活HIF-1α→HO-1信号轴发挥肾脏保护作用——在叶酸诱导的肾损伤和缺血再灌注模型中，TMZ显著上调HIF-1α并诱导HO-1表达。此外，HO-1代谢物CO通过双重机制稳定HIF-1α：抑制PHD2介导的羟基化降解和通过Hsp90激活增强其蛋白稳定性，从而建立正反馈调节环。其他研究表明，HO-1影响活性氧（ROS）水平，进而影响HIF-1α表达。因此，当HO-1被ZnPP抑制时，这个正反馈环被破坏，导致HIF-1α水平降低，这解释了我们实验中观察到的HIF-1α同时被抑制的现象。

总之，我们的研究结果确立了TMZ作为HN中PHD2/HIF-1α/HO-1通路的调节剂。通过抑制PHD2，TMZ增强了HIF-1α/HO-1信号，导致血流动力学改善、纤维化减少和炎症减弱。这些发现不仅阐明了TMZ的肾脏保护机制，而且突出了在高血压肾病中靶向该通路的治疗潜力。尽管取得了这些进展，我们的研究有几个局限性。例如，PHD2/HIF-1α/HO-1通路与其他信号通路之间可能存在相互作用，TMZ可能通过跨多个通路的协同作用发挥其肾脏保护作用；然而，具体机制需要进一步验证。此外，目前的研究基于HN的动物模型，其病理机制与人类不同，可能限制了我们研究结果的 extrapolation。未来的研究可以整合基础和临床研究以加强机制研究，采用相关技术阐明PHD2/HIF-1α/HO-1通路在TMZ介导的肾脏保护中的关键作用，并彻底剖析TMZ肾脏保护作用的调控机制，从而推进曲美他嗪在肾脏保护中的转化应用。