铁缺乏通过Breg细胞DNA高甲基化和TIGIT抑制驱动儿童特应性皮炎Th2免疫应答

本研究揭示了儿童特应性皮炎（AD）中铁缺乏通过诱导DNA高甲基化、抑制Breg细胞关键免疫检查点TIGIT表达，进而削弱IL-10+ Breg细胞功能并促进Th2炎症极化的新机制。文章首次阐明了铁代谢失衡在AD免疫失调中的因果作用，为临床营养干预提供了理论依据。

　　

Abstract

背景

儿童特应性皮炎（Atopic Dermatitis, AD）是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，常与铁缺乏共存。然而，铁稳态与AD发病机制之间的因果关系和机制尚不清楚。本研究通过分析分子通路及对疾病进展的临床影响，探讨铁缺乏在儿童AD中的病因学作用。

方法

我们根据Hanifin和Rajka标准入组了298名儿童AD患者，以评估外周铁与AD严重程度的关系，以及AD儿童血清铁、铁蛋白和转铁蛋白的水平。通过流式细胞术定量Th2细胞和产生IL-10的CD24⁺CD38⁺CD19⁺调节性B细胞（Breg）的百分比。对经Ciclopiroxolamine（CPX）处理的CD19⁺ B细胞进行RNA测序和生物信息学分析，以探索铁缺乏敏感基因。通过RT-qPCR进一步证实差异表达基因，包括具有免疫球蛋白和酪氨酸抑制基序结构域的T细胞免疫受体（TIGIT）和IL10。测定5-mC水平以评估铁缺乏对DNA甲基化的影响。使用封闭抗体抑制CD19⁺ B细胞中的TIGIT，以评估其在Breg细胞中的调节作用。

结果

与轻度AD患儿相比，重度AD患儿外周血铁离子水平较低（P<0.0001）。AD患儿血清铁（P<0.01）、铁蛋白（P<0.01）和转铁蛋白（P<0.05）水平降低，同时Th2细胞百分比升高（P<0.01），CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞减少（P<0.01）。CPX介导的铁螯合通过诱导DNA甲基化（P<0.05）和下调TIGIT（P<0.001）来抑制产生IL-10的Breg细胞（P<0.01），同时促进产生IL-4的Th2细胞扩增（P<0.05）。

结论

铁缺乏通过影响产生IL-10的Breg细胞中的DNA甲基化和抑制TIGIT，促进儿童AD中的Th2细胞扩增。

引言

儿童特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症性皮肤病，其特征是表皮屏障功能障碍、瘙痒相关搔抓循环和苔藓样湿疹斑块，源于复杂的免疫网络失调。新出现的证据强调失调的2型免疫，特别是IL-4/IL-13介导的Th2极化反应，以及调节性细胞稳态的破坏，是协调AD病理发生和持续的核心机制驱动因素。

微量元素铁是调节核心细胞稳态（如DNA合成、线粒体呼吸、氧运输、脂质、碳和葡萄糖代谢）不可或缺的酶辅助因子。铁稳态由铁蛋白、转铁蛋白（TRF）、铁转运蛋白和其他铁相关蛋白维持。长期铁耗竭影响红细胞生成并导致缺铁性贫血（IDA），这是儿科AD中的常见情况。事实上，据报道AD婴儿铁摄入不足，因为在此期间仅靠母乳喂养已无法满足其微量营养素需求。尽管推测铁缺乏与儿童AD的发展有关，但实验证据仍然缺乏。

调节性B细胞（Breg细胞，也称为B10细胞）通过产生IL-10来恢复免疫平衡。在人外周血中，CD19⁺CD24⁺CD27⁺和CD19⁺CD24⁺CD38⁺ B细胞是两种主要的功能性Breg细胞类型。来自健康个体的Breg细胞通过抑制炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17A的产生，同时通过IL-10依赖性机制诱导CD4⁺ T细胞中FOXP3⁺的表达，发挥双重免疫调节功能。最近的研究表明，在2型炎症性疾病如过敏性哮喘和特应性皮炎中，Breg细胞活性受损。产生IL-10的Breg细胞通过抑制嗜酸性粒细胞活化和组织浸润来减轻MC903诱导的小鼠AD样皮炎。然而，Breg细胞在儿童AD发病机制中的确切作用尚不清楚。

在本研究中，我们对2014年4月至2023年5月转诊至湖南省儿童医院的AD患儿进行了回顾性分析，并确定了外周铁水平与AD严重程度之间的关联。我们的数据显示AD患者中产生IL-10的CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞减少，同时血清铁和铁蛋白水平降低，且与IL-10产生呈正相关。鉴于Breg细胞IL-10依赖的免疫调节功能，我们假设铁缺乏可能损害AD发病机制中的Breg细胞活性。我们的数据进一步证明，CPX介导的铁螯合通过下调T细胞免疫受体与免疫球蛋白和酪氨酸抑制基序结构域（TIGIT）和促进DNA甲基化，显著降低了CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞的比例及其IL-10产生能力。此外，CPX处理显著增加了CD4⁺ T细胞中Th2细胞的频率和IL-4的产生。因此，本研究确定铁缺乏通过损害Breg细胞活性和加剧Th2细胞介导的2型炎症来加重AD发病机制。

材料与方法

临床和实验室数据收集

这项单中心回顾性研究分析了2014年4月至2023年5月期间转诊至湖南省儿童医院的217名AD患儿。AD诊断基于Hanifin和Rajka标准。儿童缺铁性贫血（IDA）的诊断遵循2021年WHO标准：血红蛋白<110g/L，血清铁蛋白<15μg/L或转铁蛋白饱和度<16%。排除患有其他非缺铁性贫血、其他皮肤炎症或自身免疫性疾病的患者。严重程度类别根据特应性皮炎评分（SCORAD）评估：轻度（0≤分数≤24）、中度（24<><>

人类受试者

前瞻性入组了2022年8月至2024年9月期间来自湖南省儿童医院皮肤科（包括门诊和住院队列）的81名AD患儿，用于外周血采样和后续分析。AD诊断使用Hanifin和Rajka标准建立。在同一时期从湖南省儿童医院收集了87名年龄、性别和种族匹配的健康对照。所有患者均接受局部治疗（皮质类固醇/钙调神经磷酸酶抑制剂/PDE-4抑制剂）；在样本采集时，没有人正在接受全身治疗（皮质类固醇/免疫抑制剂/生物制剂）。所有实验均根据《赫尔辛基宣言》进行，并得到湖南省儿童医院伦理委员会批准（批准号：HCHLL-2024-264）。在入组前获得了患者父母/法定监护人的书面知情同意。

ELISA和血清铁检测

从AD患者和健康对照的外周血样本中收集血清。对于血清铁检测，根据制造商的方案使用血清铁检测试剂盒（A039-1-1，南京建成生物工程研究所，中国）。使用各自的商业试剂盒按照制造商的指南进行IL-10（H009-1-1，南京建成）、转铁蛋白（H130-1-1，南京建成）和铁蛋白（H129-1-1，南京建成）的检测。

流式细胞术

用人外周血单个核细胞（PBMCs）或CD19⁺ B细胞用Zombie NIR^TM（423105，BioLegend，美国）染色以评估细胞死亡水平。Zombie NIR^TM染料阴性染色被视为活细胞。对于人类表面标志物的染色，细胞在4°C避光条件下与荧光标记的表面标志物抗体孵育30分钟。对于人类细胞内细胞因子的染色，细胞在37°C下用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）和离子霉素加GolgiPlug（550583，BD Biosciences，美国）刺激6小时。然后使用Cytofix/Cytoperm^TM固定/透化溶液试剂盒（554714，BD Biosciences）固定和透化细胞，随后在4°C避光条件下用荧光抗体再染色30分钟。对于间接流式细胞术，细胞用一抗染色并在4°C避光孵育30分钟。之后，用冰预冷的PBS洗涤三次，并用稀释的荧光标记二抗在4°C染色30分钟。为检测Fe²⁺，将FerroOrange（1 μmol/L）（F374，DOJINDO Laboratories，日本）加载到细胞中并在37°C染色30分钟。细胞因子和表面标志物的表达通过使用BD FACS LSR Fortessa（BD Biosciences）的流式细胞术检测，然后数据由BD FACSDiva（BD Biosciences）收集并由Flowjo软件（Tree Star）分析。

体外人类PBMCs和CD19⁺ B细胞活化

通过密度梯度离心（17544203-1，Cytiva，美国）从健康供体外周血中分离人PBMCs，然后用2 μg/mL抗CD3（217,570-100UGCN，Sigma，美国）和1 μg/mL抗CD28（217,669-100UGCN，Sigma）刺激48小时。细胞培养后，收集PBMCs以确定Breg细胞和Th2细胞的百分比，以及Breg细胞中IL-10的产生。对于CD19⁺ B细胞活化，通过使用人CD19微珠（130-050-301，Miltenyi Biotec，德国）进行阳性选择从PBMCs中分离CD19⁺ B细胞，然后在10 μg/mL抗IgM（109-006-129，Jackson ImmunoResearch，美国）和1 μg/mL CD40L（310-02-50UG，PeproTech，美国）的刺激下培养72小时。刺激后，收集细胞以通过流式细胞术评估CD19⁺CD24⁺CD27⁺ Breg细胞和CD19⁺CD24⁺CD38⁺ Breg细胞的百分比以及IL-10表达。

体外铁耗竭

从健康供体的外周血中分离PBMCs或CD19⁺ B细胞，并使用环吡酮胺（CPX）（20 μM）（C2162700，Sigma，美国）进行铁耗竭。铁耗竭后，PBMCs在2 μg/mL抗CD3（Sigma）和1 μg/mL抗CD28（Sigma）的刺激下培养48小时。同时，根据先前的研究，CD19⁺ B细胞用1 μg/mL CD40L（PeproTech）和10 μg/mL抗IgM（Jackson ImmunoResearch）刺激72小时。

RNA提取和qPCR

使用TRIzol试剂（TR118，MRC，美国）从细胞中提取总RNA。随后使用NanoDrop分光光度计（ND-2000，Thermo Fisher Scientific）评估RNA完整性。RNA提取后，根据制造商的说明，使用用于qPCR的Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean（AG11728，准确生物学，中国）进行cDNA合成。使用LightCycler 480 II（Roche）分析各种基因的转录本表达。使用ΔΔCt方法计算每个基因的相对mRNA表达水平，阈值循环（Ct）值归一化至参考基因（ACTB或GAPDH）并相对于对照组进行校准。相关引物列于补充表1。

RNA测序和生物信息学分析

对于细胞制备，从健康供体的外周血中分离人CD19⁺ B细胞，然后在1 μg/mL CD40L（PeproTech）和10 μg/mL抗IgM（Jackson ImmunoResearch）的条件下培养3天。根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（MRC）从刺激的CD19⁺ B细胞中提取总RNA，随后提交给诺禾致源有限公司进行RNA测序。RNA测序工作流程包括总RNA质量评估、mRNA纯化、双链cDNA合成、末端修复/dA加尾、基于大小的片段选择、PCR扩增、文库质量控制和最终在Illumina平台上测序。使用“DESeq2” R包鉴定差异表达基因（DEGs），调整后P值 < 0.05且倍数变化 > 1.5为标准。使用R软件（版本4.3.3）中的“heatmap”、“prcomp”和“ggplot2”包进行热图、主成分分析（PCA）和DEGs可视化。使用“clusterProfiler”和“msigdbr”包进行富集分析，包括基因集富集分析（GSEA）、基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）。对所有分析结果进行可视化以进行生物学解释。测序数据可根据合理要求向通讯作者索取。

TIGIT阻断试验

为评估TIGIT阻断对Breg细胞扩增的影响，CD19⁺ B细胞在1 μg/mL CD40L（PeproTech）、10 μg/mL抗IgM（Jackson ImmunoResearch）和10 μg/mL TIGIT阻断抗体（Invitrogen）的条件下培养。3天后，收集CD19⁺ B细胞，通过流式细胞术测定CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞的百分比。

统计分析

使用非配对Student's t检验评估AD患者与健康对照之间的比较分析。对于多组比较，数据集通过普通单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行分析。在检查铁代谢干预（耗竭组和对照组）的差异时，应用配对Student's t检验。应用Pearson相关进行相关性分析。除非另有说明，所有数据均表示为平均值±SEM，统计显著性阈值在相应图注中指定。P值<0.05被认为具有统计学显著性。

结果

AD儿童外周铁浓度降低

为确定外周铁与儿童AD之间的关联，我们回顾性分析了2014年4月至2023年5月转诊至湖南省儿童医院的217例AD患儿的实验室数据。我们发现，重度AD患儿（平均值±SEM：366.9±9.885 ug/mL）的血液铁水平远低于其他组（平均值±SEM：轻度：411.7±4.730 ug/mL，中度：395.1±8.797 ug/mL）。这三组之间的血红蛋白（HGB）水平无显著差异（平均值±SEM：轻度：120.0±0.990 g/L，中度：121.6±1.650 g/L，重度：118.8±1.743 g/L）。通过ELISA检测AD患者和匹配健康对照的血清铁、铁蛋白和转铁蛋白水平。比较分析显示，AD患者的血清铁（平均值±SEM：NC：1.943±0.077 mg/L，AD：1.593±0.090 mg/L）、铁蛋白（平均值±SEM：NC：28.57±0.804 ng/mL，AD：25.73±0.621 ng/mL）和转铁蛋白（平均值±SEM：NC：1.797±0.026 g/L，AD：1.712±0.022 g/L）水平显著低于健康儿童。这些数据支持了AD儿童铁状态改变的假设。

铁螯合抑制外周血中IL-10⁺ Breg细胞的扩增

接下来，我们检测了外周血中两个关键Breg细胞亚群（CD24⁺CD38⁺CD19⁺和CD24⁺CD27⁺CD19⁺）的比例，这些细胞已知可调节免疫反应。AD患者与健康对照之间CD19⁺ B细胞的百分比无统计学显著差异（平均值±SEM：NC：5.818±0.971%，AD：4.593±0.808%）。AD患者中CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞的百分比显著降低（平均值±SEM：NC：12.44±1.467%，AD：7.358±0.967%），但两组之间CD24⁺CD27⁺CD19⁺ Breg细胞未观察到显著差异（平均值±SEM：NC：4.377±0.337%，AD：4.192±0.434%）。此外，AD组CD19⁺ B细胞中IL-10的产生也显著降低（平均值±SEM：NC：16.44±2.246%，AD：9.398±1.900%）。我们使用ELISA检测血清IL-10，发现与健康儿童相比，AD患者的水平降低（平均值±SEM：NC：76.70±2.204 ng/L，AD：71.00±1.641 ng/L）。结果还显示，IL-10水平与血清铁和铁蛋白呈正相关。为研究铁状态是否影响Breg细胞的生物活性，我们用铁螯合剂CPX处理CD19⁺ B细胞。在CD40L和抗IgM激活的CD19⁺ B细胞中，CPX显著抑制了CD24⁺CD27⁺CD19⁺ Breg细胞的扩增和IL-10产生。类似地，与DMSO处理的对照组相比，CPX处理组中CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞及其IL-10产生能力显著降低。

铁缺乏影响CD19⁺ B细胞的多种生物学功能

为研究铁缺乏调节Breg细胞的分子机制，我们对CPX处理的CD19⁺ B细胞进行了RNA测序。使用PCA分析所有基因的表达。PC1和PC2共同解释了总方差的80%。后续分析侧重于CPX处理的CD19⁺ B细胞中的DEGs。与DMSO组相比，CPX组表现出696个DEGs，包括208个下调和488个上调。对696个DEGs的GO富集分析显示，CPX相对于DMSO与细胞分裂、蛋白质折叠调节、蛋白质泛素化负调控和自噬体组装密切相关。在CPX处理的细胞中，显著富集的条目包括包涵体组装负调控、蛋白质再折叠调节和缺氧反应。而在DMSO处理的细胞中，主要的生物学过程是染色体组织调节、细胞周期相变调节、细胞器组织负调控、细胞周期负调控和细胞激活正调控。KEGG通路分析显示，CPX相对于DMSO参与内质网中的蛋白质加工、脂质和动脉粥样硬化、细胞衰老、病毒感染和自噬。CPX中显著富集的KEGG通路与果糖和甘露糖代谢、HIF-1信号通路、矿物质吸收和内质网中的蛋白质加工有关。同时，DMSO中富集的顶级KEGG通路与肠道免疫网络用于IgA产生、细胞周期、Th1和Th2细胞分化以及T细胞受体信号通路有关。使用分子特征数据库的GSEA分析进一步比较了CPX和DMSO组之间的表达谱。结果显示，CPX组中显著富集的基因产物主要位于糖酵解、血红素代谢、炎症反应和通过NFKB的TNFA信号通路中。几个Breg细胞相关基因，如TIGIT、CD80、CD84、CD274、TNFRSF8、IL2、IL10和IL15在CPX组中显著下调。这些发现表明铁缺乏在抑制Breg细胞功能中起关键作用。

铁缺乏通过促进DNA甲基化和抑制TIGIT表达抑制Breg细胞扩增

我们接下来测定了CD40L和抗IgM刺激后CPX处理的CD19⁺ B细胞中Breg细胞相关基因的表达水平。关键调节基因（TIGIT、IL-10、IL-2、CD274、IRF5、IL-15、CSF2、CD80、CD84）显示出显著下调，这与它们在Breg介导的调节功能中的既定作用一致。值得注意的是，VEGFA——AD发病机制中的核心炎症介质——矛盾地上调。相反，CXCR4和ZNF10，涉及Th2介导的炎症和T细胞活化，在CPX处理的B细胞中表现出不显著的上调趋势。据报道，TIGIT关键调节Breg细胞分化和功能，其表达受DNA甲基化调节。我们之前的研究表明，铁稳态通过调节DNA甲基化影响基因表达。为研究铁缺乏是否影响TIGIT表达和DNA甲基化，我们通过流式细胞术检查了CPX处理的CD19⁺ B细胞中TIGIT和5-mC的表达水平。结果显示，CPX处理抑制了CD24⁺CD27⁺CD19⁺ Breg细胞中TIGIT的表达并增加了5-mC水平。然后我们用TIGIT阻断抗体处理CD19⁺ B细胞，以探索TIGIT在调节Breg细胞分化中的作用。结果显示，TIGIT抑制显著降低了CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞的扩增。总之，这些结果表明铁缺乏通过促进DNA甲基化和抑制TIGIT表达来抑制Breg细胞扩增。

铁缺乏促进外周血中产生IL-4的Th2细胞

由于Th细胞平衡在AD发展中起关键作用，我们接下来测定了AD患者中Th细胞亚群的百分比。分析显示，AD患者和健康对照之间的CD4⁺ T细胞群体相当。AD患者中CD4⁺CCR4⁺CXCR3^?CCR6^? Th2细胞的频率高度增加。然而，CD4⁺CXCR3⁺CCR6^? Th1细胞和CD4⁺CCR6⁺CXCR3^? Th17细胞的频率在AD组和对照组之间相当。为研究铁缺乏是否影响Th2细胞活性，使用流式细胞术分析经CPX处理的PBMCs中的Th2频率。结果显示，与DMSO处理组相比，CPX处理显著增加了CD4⁺CCR4⁺CXCR3^? Th2细胞的百分比。尽管CD4⁺CXCR3⁺CCR4^? Th1细胞的百分比在组间无显著差异，但CPX处理显著降低了Th1/Th2比率。此外，与对照组相比，CPX处理显著增加了CD4⁺IL-4⁺ Th2细胞的频率。

讨论

我们的研究证明儿科AD患者存在全身性铁缺乏，包括外周血铁、血清铁、铁蛋白和转铁蛋白降低。据报道，铁储存增加与过敏性疾病呈负相关。我们的数据显示AD患者外周血和血清铁水平显著降低，表明铁缺乏与AD发展相关。多项流行病学研究报告称，IDA在AD患儿中非常普遍。几项横断面研究表明，儿科AD患者患IDA的风险更高（调整后的优势比范围为1.42至1.83）。日本最大的出生队列研究发现，患有AD的2岁儿童在一年内患贫血的几率高出2.18倍（95% CI 1.66–2.85）。土耳其的一项回顾性研究显示，AD儿童中IDA的发生率（15%）高于健康对照（5%）。早发性AD、严重的SCORAD评分、皮肤感染和多种特应性疾病与这些患者中较高的IDA发生率相关。儿科AD中IDA患病率的差异可能归因于饮食习惯和人口因素。然而，我们未观察到轻度、中度和重度AD组之间HGB水平的显著差异。

我们的研究结果揭示，铁缺乏诱导免疫细胞谱改变，特别是损害CD24⁺CD38⁺CD19⁺ Breg细胞活性，同时促进Th2细胞扩增。产生IL-10的Breg细胞对过敏性疾病具有保护作用。在哮喘小鼠中，肺部产生IL-10的Breg细胞数量显著减少，表明过敏性哮喘期间Breg细胞稳态被破坏。与先前的儿科AD研究一致，我们的数据显示血清IL-10水平、CD19⁺CD24⁺CD38⁺ Breg细胞百分比和IL-10产生能力同时降低。此外，我们确定了AD患儿血清铁与IL-10水平之间呈正相关。值得注意的是，CPX介导的铁螯合抑制了CD19⁺CD24⁺CD38⁺ Breg细胞中的IL-10表达，表明铁缺乏损害了AD发病机制中的Breg细胞功能。先前的研究表明，铁缺乏条件下的免疫激活优先扩增Th2细胞，而保留Th1对应物。相反，铁过载促进T细胞活化并驱动Th1、Th17和滤泡辅助T（Tfh）细胞的分化。此外，铁过载可通过Fenton反应（也称为铁死亡）加剧氧化损伤和组织损伤，这是炎症性疾病的触发因素。铁死亡已与实验小鼠模型中的气道炎症相关，并且在哮喘患者的肺部检测到铁水平升高和脂质过氧化产物。鉴于这一证据，过量的铁补充可能无益