北非藏红花化学表征与药理特性研究：基于计算机模拟和体外方法的抗氧化、抗胆碱酯酶及抗脂肪酶活性与毒性评估

本文通过计算机模拟（in silico）和体外（in vitro）方法，系统研究了北非藏红花花瓣与柱头提取物的化学成分、抗氧化、抗胆碱酯酶（AChE/BChE）、抗脂肪酶活性及其药代动力学（ADMET）特性。研究发现藏红花生物活性成分在食品保鲜及神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）和肥胖症的新型治疗策略开发中具有巨大潜力。

　　

ABSTRACT

藏红花（Crocus sativus）作为鸢尾科植物，因其独特的颜色、香气和味道而被广泛认为是一种宝贵的天然调味剂。本研究旨在探究藏红花花瓣和柱头提取物的生物活性潜力，重点关注其抗氧化、抗胆碱酯酶和抗脂肪酶活性，同时评估其药代动力学特性和安全性。

Introduction

近年来，药用植物的使用显著增加，无论是通过冲泡饮用还是提取其生物活性成分用于药物生产。当前对植物提取物的生物学研究通常验证了许多物种的传统用途，但仍需进一步证据为合理的植物疗法奠定坚实基础。藏红花（Crocus sativus）即为其中一种重要草药。它是一种多年生球茎植物，秋季开花，每朵花有三个黄色雌蕊和三个红橙色柱头，这些柱头提供了藏红花。藏红花在克什米尔、伊朗、土耳其及地中海地区多个国家广泛种植。近年来，公众对天然添加剂作为合成化学品替代品的兴趣日益增长，显著增加了藏红花在食品工业中作为天然调味剂的使用。本研究旨在表征藏红花花瓣和柱头的化学成分，并评估其抗氧化和酶抑制特性，包括抗胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶）和抗脂肪酶活性。此外，应用分子对接和ADMET预测方法在分子水平验证生物活性并评估其药代动力学和安全性特征。

Materials and methods

Plant material

藏红花花朵采集自阿尔及利亚比斯克拉省乌塔亚地区，花瓣和柱头经过干燥处理。样本由Kechebar Mohamed Seif Allah教授鉴定，标本凭证存放于干旱地区科学技术研究中心植物标本馆。

Extraction of bioactive compounds

花瓣和柱头分别用甲醇和乙醇通过浸渍法提取，得到甲醇花瓣提取物（MEP）、甲醇柱头提取物（MES）、乙醇花瓣提取物（EEP）和乙醇柱头提取物（EES），提取物储存于4°C冰箱备用。

Gas chromatography coupled with mass spectroscopy (GC-MS)

采用安捷伦科技GC 17A气相色谱仪联用HP 5 MS色谱柱进行GC-MS分析。通过对比NIST和Wiley质谱库以及文献报道的保留指数和质谱裂解模式对化合物进行鉴定。

Evaluation in vitro of antioxidant activity

通过DPPH自由基清除实验、ABTS阳离子自由基清除实验、铁离子还原抗氧化能力（FRAP）实验、银纳米颗粒（SNP）还原实验和邻二氮杂菲（Phenanthroline）实验评估提取物的抗氧化活性。结果以IC₅₀或A_0.5值表示，并与标准抗氧化剂BHA、BHT和抗坏血酸进行比较。

Enzymatic inhibition activities

Anticholinesterase activity

通过测定提取物对乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的抑制活性来评估其抗胆碱酯酶活性。加兰他敏作为阳性对照，结果以IC₅₀值表示。

Anti-lipase activity

评估提取物对脂肪酶的抑制活性，奥利司他作为阳性对照，结果以IC₅₀值表示。

Statistical analysis

所有参数进行单因素方差分析（ANOVA），若ANOVA检验显著（p < .05），则采用Tukey多重比较检验进行均值差异分析。

Molecular modelling

分子对接分析旨在评估从藏红花中提取的五种关键化合物与三种酶活性位点的相互作用：胰腺脂肪酶（PDB: 1ETH）、乙酰胆碱酯酶（AChE, PDB: 4EY6）和丁酰胆碱酯酶（BChE, PDB: 7AIY）。这五种化合物包括：6-氨基-5-氰基-4-(5-氰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)-2-甲基-4H-吡喃-3-羧酸乙酯、8,11-二甲基-9,10-二苯基二环[5.4.0]十二碳-2,5,7(1),8,10-五烯、苯, 2-[(叔丁基二甲基硅烷基)氧基]-1-异丙基-4-甲基、苯磺酰胺, 4-(9-吖啶基氨基)和甲基 3-溴-1-金刚烷乙酸酯。从蛋白质数据库（PDB）获取酶的三维结构，使用Chimera软件去除杂原子和水分子，并重建晶体结构中缺失的原子。使用AutoDock Tools进行能量最小化以优化结构。使用Chimera和AutoDock Vina模拟化合物与酶的相互作用，并使用Discovery Studio Visualizer分析和可视化对接结果。

Docking validation

通过将晶体结构中的天然配体重新对接到其各自的活性位点来验证对接方法的准确性。计算实验结构中天然配体位置与对接模拟预测位置之间的均方根偏差（RMSD）。RMSD ≤ 2.0 ?被认为是可以接受的，表明可靠地再现了天然配体构象。

ADMET (absorption distribution metabolism excretion), toxicological property, and PASS prediction

使用SwissADME在线服务器预测所选化合物的类药性和药代动力学性质。使用ProTox-II网络服务器基于肝毒性、致癌性、细胞毒性、致突变性和免疫毒性等参数预测毒性。使用PASS Online进行生物活性预测。

Results and discussion

GC-MS of polar extracts

GC-MS分析在甲醇提取物中鉴定出28种化合物，在乙醇提取物中鉴定出50种成分。MEP和EEP中分别发现18和32种成分，主要化合物包括1,8-二羟基-3-甲基苯并[b]菲啶-5,7–12-三酮（21.895%）、1,2,3-三苯基-4,5,6,7-四氢吲哚（13.650%）、1-(4-硝基苯基)-3-苯基-3,4-二(羧乙基)-吡唑啉（12.634%）和2-乙基吖啶（8.247%）、二十烷（7.55%）、13-十四碳烯-1-醇乙酸酯（7.526%）等。MES和EES中分别鉴定出13和15种成分，主要成分包括8,11-二甲基-9,10-二苯基二环[5.4.0]十二碳-2,5,7(1),8,10-五烯（19.698%）、苯磺酰胺, 4-(9-吖啶基氨基)（16.667%）、甲基 3-溴-1-金刚烷乙酸酯（10.562%）、2-丙醇, 1,1'-氧基双-（77.472%）、阿斯特拉酮（6.022%）和9-氨基-1-苯基-3,6-二氮杂高金刚烷（4.379%）等。

Antioxidant assessment

抗氧化活性评估显示，MEP提取物在ABTS自由基清除实验中表现出最强的活性（IC₅₀: 20.31 ± 2.39 μg/mL），而MES提取物在邻二氮杂菲实验中表现最佳（A_0.5: 27.06 ± 1.44 μg/mL）。在FRAP实验中，MES提取物显示出最强的抗氧化活性（A_0.5: 42.15 ± 0.78 μg/mL），优于所有使用的标准品。在SNP实验中，所有提取物均表现出较弱的抗氧化活性。

Bioassays

Anticholinesterase activity

酶抑制研究表明，只有MES提取物能显著抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE），其IC₅₀值分别为131.82 ± 3.03 μg/mL和19.76 ± 1.20 μg/mL。值得注意的是，MES对BChE的抑制活性优于阳性对照加兰他敏。

Anti-lipase activity

抗脂肪酶活性结果显示，MES提取物具有最佳的活性（IC₅₀: 164.78 ± 0.61 μg/mL），其次是EEP（IC₅₀: 682.63 ± 2.75 μg/mL）和EES（IC₅₀ > 500 μg/mL），而MEP无活性。这些结果远不如奥利司他（IC₅₀: 0.22 ± 0.01 μg/mL）。

植物提取物的化学成分、抗氧化潜力和生物活性受到多种因素的影响，包括地理来源、提取方法、植物成熟度、物候阶段、加工和储存条件、物种或品种差异、生态和环境胁迫以及溶剂的选择。

Molecular docking

分子对接结果显示，所选化合物与靶蛋白（4EY6, 7AIY, 1ETH）表现出较强的结合亲和力，结合自由能（ΔG）在-8.3至-9.4 kcal/mol之间。对接验证的RMSD值分别为1.71 ?（1ETH）、1.56 ?（4EY6）和1.83 ?（7AIY），表明对接方案可靠。分子相互作用分析揭示了这些化合物与关键蛋白残基（如4EY6中的TYR130、SER122和TRP83，以及7AIY中的TRP80和HIS436）形成重要的键合，包括常规氢键、π-π堆积和碳-氢键，这解释了它们的高结合亲和力和潜在的抑制效果。与天然配体相比，某些化合物（如8,11-二甲基-9,10-二苯基二环[5.4.0]十二碳-2,5,7(1),8,10-五烯）表现出更有利的对接分数，表明其具有更强的结合能力和更大的治疗潜力。

Bioavailability and pharmacokinetics

计算机ADMET特性分析表明，所选化合物均符合Lipinski规则，其中6种符合Egan规则和Verber规则，所有化合物的生物利用度评分均为0.55，反映出良好的类药特性。皮肤渗透性（Log Kp）值范围从-7.42 cm/s（渗透性最差）到-0.60 cm/s（渗透性最佳），表明化合物皮肤渗透性较低。除苯磺酰胺, 4-(9-吖啶基氨基)（肝毒性）、甲基 3-溴-1-金刚烷乙酸酯（致癌性）和2-乙基吖啶（致癌性）外，其他化合物均未预测具有肝毒性、致癌性、细胞毒性、免疫毒性或致突变性。大多数化合物（6种）的LD₅₀ > 2000 mg/kg，表明它们可用于药物递送。细胞色素P450酶抑制预测显示部分化合物可能抑制CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9和CYP2D等同工酶。煮蛋模型预测表明，部分化合物可能穿透血脑屏障（BBB），且大多数化合物不是P-糖蛋白（P-gp）的底物，这有利于其分布和消除。

毒性学分析显示，毒性最大的化合物是苯磺酰胺, 4-(9-吖啶基氨基)（肝毒性和致癌性，LD₅₀为1500 mg/kg，IV级）以及2-乙基吖啶和二十烷（III级）。毒性最小的化合物是2-丙醇, 1,1'-氧基双-和13-十四碳烯-1-醇乙酸酯（LD₅₀为14,800 mg/kg，VI级），甲基 3-溴-1-金刚烷乙酸酯和阿斯特拉酮（V级）也被认为是低毒性的。含有吖啶环的化合物似乎具有较高的毒性风险，而长链烃和酯类则倾向于具有较低的毒性。

PASS分析揭示了所选化合物和标准品潜在的药理活性。当Pa大于Pi时，表明存在潜在的显著活性。所选化合物显示出多种显著活性，如抗糖尿病、抗氧化、胰岛素促进、自由基清除和α-葡萄糖苷酶抑制等特性，其潜在活性值（Pa）范围从0.025到0.622。标准化合物的活性值范围从0.09到0.92。值得注意的是，2-丙醇, 1,1'-氧基双-和二十烷表现出较高的胰岛素促进活性（Pa值分别为0.592和0.622）。2-乙基吖啶和二十烷显示出较强的脂质过氧化物酶抑制活性（Pa值分别为0.399和0.411）。几种被测化合物显示出显著的自由基清除潜力。标准化合物如BHT、抗坏血酸和BHA表现出较高的抗氧化和自由基清除特性。

Conclusion

本研究考察了藏红花花瓣和柱头的甲醇及乙醇提取物的化学成分，并评估了其抗氧化、抗酶活性和药代动力学特性。虽然某些提取物活性有限，但甲醇柱头提取物（MES）尤其显示出显著的抗氧化、抗胆碱酯酶和抗脂肪酶作用。对该提取物主要成分的分子对接进一步证实了其酶抑制潜力。ADMET预测也显示出良好的安全性，无致突变性且LD₅₀值较高，支持了它们在治疗领域的应用潜力。这些发现表明，选定的藏红花提取物，特别是来自柱头的提取物，可能在食品保鲜以及神经退行性疾病和肥胖症的治疗方法开发中具有重要价值，尽管还需要进一步的体内验证。