综述：解析生物源纳米颗粒及其蛋白冠的形成：当前技术与分析挑战

本综述系统评述了生物源纳米颗粒（bioNPs）的绿色合成途径及其蛋白冠（PC）形成的分析策略。文章重点探讨了利用植物、真菌和细菌等生物体系合成纳米颗粒的可持续方法，并详细比较了活体生物合成与提取物介导的“伪绿色”合成之间的差异。作者强调了蛋白冠对纳米颗粒稳定性、生物特性及功能（如抗癌、抗菌活性）的关键影响，同时指出当前研究在实时原位表征方面的技术挑战。通过对电子显微镜（TEM/SEM）、光谱学（UV-Vis、FTIR、SERS）和质谱（LC-MS/MS）等技术的优缺点分析，为绿色纳米技术的安全应用提供了关键方向。

　　

生物源纳米颗粒合成的多样性：活体生物途径与提取物方法

生物源纳米颗粒合成以其环境友好特性成为传统化学方法的重要替代方案。活体微生物（如细菌、真菌）和植物通过细胞内或细胞外途径还原金属离子，形成具有生物分子冠层的纳米颗粒。细胞内合成依赖酶系统（如NADH依赖型还原酶）在细胞壁或胞内器室完成还原，形成尺寸可控的纳米颗粒；细胞外合成则通过分泌的蛋白质、多糖等生物分子在介质中实现还原与稳定化。提取物介导的“伪绿色”合成虽简化了流程，但生物分子在提取过程中的修饰可能导致纳米颗粒特性差异。

活体系统作为生物源纳米颗粒的“纳米工厂”

细菌如乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）和芽孢杆菌（Bacillus cereus）可合成银纳米颗粒（AgNPs），而真菌如曲霉（Aspergillus flavus）和青霉（Penicillium sp.）则擅长生成金纳米颗粒（AuNPs）和硒纳米颗粒（SeNPs）。藻类（如Tetraselmis kochinensis）和植物（如紫花苜蓿）通过积累金属离子并利用代谢物（如类黄酮、酚酸）实现纳米颗粒的生物合成。这些生物体系合成的纳米颗粒天然包裹着蛋白质、多糖等生物分子，形成独特的“生物身份”，直接影响其生物活性和应用潜力。

生物源纳米颗粒的提取与分离策略

纳米颗粒的提取方法需根据研究目标（核心特性或蛋白冠分析）定制。提取物合成的纳米颗粒可通过离心或过滤直接分离；而细胞内纳米颗粒需采用酶解（如蛋白酶K）或化学处理（如四甲基氢氧化铵）释放。密度梯度离心（DGC）和场流分离（AF4）等技术可用于分离完整的纳米颗粒-蛋白冠复合物，但现有方法对生物源纳米颗粒蛋白冠的保存仍存在挑战。

核心表征技术：从形貌到元素组成

透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）可提供纳米颗粒尺寸、形状和聚集状态的高分辨率图像，结合能量色散X射线光谱（EDX）还能分析元素组成。原子力显微镜（AFM）可在近原子分辨率下分析表面形貌，而动态光散射（DLS）则用于测定流体动力学直径和Zeta电位。单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICP-MS）能定量纳米颗粒浓度并追踪其生物转化过程，例如在细菌中观察碲纳米颗粒（TeNPs）向纳米棒的转变。

表面化学表征：揭示蛋白冠的组成与动态

紫外-可见分光光度法（UV-Vis）通过表面等离子体共振（SPR）峰位移间接监测蛋白冠形成；傅里叶变换红外光谱（FTIR）可识别蛋白质二级结构变化（如α-螺旋向β-折叠转变）；表面增强拉曼光谱（SERS）则能分析冠层蛋白质的构象变化。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是蛋白冠定性与定量分析的黄金标准，例如在真菌Macrophomina phaseolina合成的银纳米颗粒中鉴定出46种冠层蛋白质。新兴技术如暗场显微术（HEDFM）与微流控结合，可实时观测蛋白冠的动力学形成过程。

应用前景与挑战

生物源纳米颗粒在生物医学（药物递送、抗癌治疗）、环境修复（污染物催化降解）及农业（纳米肥料）等领域展现巨大潜力。然而，批次间差异、提取过程对蛋白冠的影响以及原位形成机制的模糊性仍是主要瓶颈。未来需开发实时原位分析平台（如质谱流式技术CyTOF），结合多组学方法，建立纳米颗粒结构-表面化学-生物效应的完整关联图谱，推动绿色纳米技术的标准化与临床应用。