乳酸乳酪杆菌胞外多糖的结构表征及其对巨噬细胞免疫调节活性的研究

本研究针对益生菌来源胞外多糖(EPS)免疫调节机制不清的问题，通过系统表征Lacticaseibacillus casei AP/AG菌株EPS的理化特性，发现其能显著增强RAW 264.7巨噬细胞的吞噬活性和一氧化氮(NO)产生（浓度50-800 μg/mL），且无细胞毒性。该研究为开发基于EPS的功能性食品和药物提供了理论依据。

　　

在功能性食品和医药领域，微生物来源的胞外多糖(EPS)因其独特的生物活性备受关注。乳酸酸菌(LAB)作为公认的安全菌株，其产生的EPS具有调节肠道菌群、抗氧化和免疫调节等多种功能。然而，不同菌株来源的EPS其结构和功能存在显著差异，特别是从特殊生境（如健康婴儿肠道）分离的益生菌株，其EPS的免疫调节机制尚不明确。Lacticaseibacillus casei AP和L. casei AG是从印度尼西亚母乳喂养婴儿肠道中分离的益生菌，前期研究表明其发酵乳制品具有降胆固醇等健康益处，但其所产EPS的详细特性及免疫活性仍有待揭示。

本研究旨在系统表征L. casei AP和L. casei AG所产EPS的理化性质，并评估其对巨噬细胞RAW 264.7的免疫调节作用。研究人员采用批量发酵模型培养细菌，通过醇沉、透析和冻干获得粗EPS；采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析官能团，高效液相色谱(HPLC)测定单糖组成，扫描电子显微镜-能谱联用(SEM-EDX)观察形貌和元素组成；通过MTT法检测细胞毒性，中性红吞噬实验和Griess法分别评估巨噬细胞吞噬活性和一氧化氮(NO)产量。

细菌生长

L. casei AP和AG均为革兰氏阳性杆菌，在MRS肉汤中培养4小时进入对数生长期，17小时到达稳定期。此时AP和AG的活菌数分别达4.3×10⁹ CFU/mL和6.2×10⁹ CFU/mL。生长曲线监测为确定EPS最大产量收获时间（28小时）提供了依据。

EPS的提取与结构表征

L. casei AP和AG的EPS产量分别为48 mg/L和62 mg/L，碳水化合物含量分别为79.40%和81.17%。FTIR光谱显示两种EPS均含有羟基、羧基和酰胺基团，并在817.82 cm^-1处有吸收峰，表明存在α-糖苷键构型。HPLC分析发现两种EPS均含有核糖和葡萄糖，但保留时间6.7分钟的峰未能鉴定。SEM显示EPS呈不规则块状，表面粗糙。EDX分析表明主要元素为C、O、N和Ca，值得注意的是，仅L. casei AP的EPS中含有磷(P)，占比1.2%，这可能是其免疫活性差异的关键因素。

EPS的免疫调节活性

细胞毒性实验表明，50-800 μg/mL浓度的两种EPS对RAW 264.7细胞均无毒性。吞噬实验显示，两种EPS均能显著提高巨噬细胞的吞噬指数，L. casei AP EPS在400 μg/mL时吞噬活性最高（达对照的310%），而L. casei AG EPS在500 μg/mL时最高（282%）。在NO产生实验中，两种EPS均能剂量依赖性地促进NO分泌，L. casei AP EPS在800 μg/mL时诱导NO产量达18.730 μM，显著高于L. casei AG EPS的14.603 μM。阳性对照LPS(1 μg/mL)的NO产量为21.75 μM。

研究结论表明，尽管同属L. casei，但AP和AG菌株产生的EPS在产量、元素组成（特别是磷的有无）和免疫调节活性上存在差异。两种EPS均能安全、有效地激活巨噬细胞，增强其吞噬功能和NO产生能力，展现出良好的免疫增强潜力。这种活性差异可能与EPS的分子量、分支结构、单糖组成以及磷酸基团等取代基有关，磷酸基团的存在可能通过影响EPS与免疫细胞表面受体（如TLR4）的相互作用，从而增强免疫刺激效果。

该研究首次详细报道了人源益生菌L. casei AP和AG所产EPS的结构与免疫活性，为将这两株菌及其EPS应用于开发具有免疫调节功能的功能性食品、乳制品和医药产品提供了重要的科学依据。研究成果发表于《FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》，对推动益生菌资源的深度开发和利用具有重要意义。