高灵敏度钙钛矿标记纳米抗体电化学发光免疫传感器用于基于刺突(S1)蛋白生物标志物的持续性病毒库检测

本文推荐一种基于钙钛矿纳米材料标记和纳米抗体识别的新型电化学发光免疫传感器，用于高灵敏检测SARS-CoV-2 S1蛋白。研究人员通过构建AuSPE||strep|Nb1|BSA|biotin|S1|strep-LiSmZrO3-Nb2+BSA夹心结构，实现了对持续性病毒库生物标志物的检测，检测限达0.04 pg mL?1，为长新冠诊断提供了新工具。

　　

在新冠疫情后期，临床医生面临着一个严峻挑战：持续性病毒库(Persistent Viral Reservoirs, PVR)和潜伏性COVID-19感染。这些隐藏的病毒避难所存在于大脑、胃肠道、肺部、淋巴组织等部位，即使在急性感染消退后仍能长期存留病毒RNA、蛋白质或抗原，被认为是导致长新冠症状的关键驱动因素。然而，标准诊断方法往往无法检测到这些隐藏部位的病毒，使得PVR的检测和表征变得异常困难。

传统检测方法主要依赖酶联免疫吸附测定(ELISA)系统，使用抗体作为免疫系统的识别组件。但抗体存在明显局限性：它们结构庞大复杂，批次间变异性大，随机附着到支撑物上可能导致功能部分丧失。更重要的是，多克隆抗体的批次间变异性会阻碍蛋白质工程的发展。

面对这些挑战，研究人员开始将目光转向重组抗体和非抗体结合蛋白。其中，纳米抗体(Nanobody, Nb)作为一种新兴的识别元件，展现出独特优势。这些来自骆驼科动物的重链抗体可变域，具有更高的热稳定性和灵活性，改进的溶解性，易于重组表达，并能与多种抗原相互作用。更重要的是，它们尺寸小，半衰期短，能够被肾脏快速清除未结合部分，且能够通过各种细菌和酵母大规模生产。

与此同时，生物传感器领域也在快速发展。特别是将纳米材料融入系统已成为提高生物传感器效率、准确性和敏感性的重要策略。在众多纳米材料中，钙钛矿纳米材料因其独特的电化学稳定性、铁电性、超导性和优异的催化活性而崭露头角。虽然钙钛矿纳米材料已在癌症和肾脏生物标志物的各种生物传感平台中得到应用，但它们在SARS-CoV-2抗原-抗体传感器中的应用仍 largely unexplored。

在这项发表于《Bioelectrochemistry》的研究中，研究团队开创性地将钙钛矿纳米材料(LiSmZrO₃)与纳米抗体技术相结合，开发了一种新型电化学发光免疫传感器，专门用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白(S1)——这一被确认为持续性病毒库和潜伏COVID-19早期检测的明确生物标志物。

研究人员采用了几项关键技术方法：使用金丝网印刷电极(AuSPE)作为传感平台；通过链霉亲和素-生物素(strep-biotin)相互作用固定化生物素化纳米抗体；利用锂钐锆氧化物(LiSmZrO₃)钙钛矿纳米材料作为信号放大器；采用电化学发光(ECL)检测技术进行信号转导；并在缓冲溶液和人类血清样本中进行了可行性验证。

2. Materials

研究使用了分析级试剂，包括异丙醇、EDC、NHS、杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、牛血清 albumin (BSA)和人类血清。LiSmZrO₃钙钛矿纳米材料采用先前合成和充分表征的批次。SARS-CoV-2刺突RBD-His重组蛋白购自 Sino Biological Europe GmbH。纳米抗体Nb1RBDnoCys (Nb₁)和Nb2RBDNoCys (Nb₂)通过将cDNA克隆到pET22b载体中生产，并使用镍亲和树脂纯化。

纳米抗体选择方面，研究基于Xiaojing Chi等人的工作，选择了Nb1和Nb2这两种对刺突蛋白表现出特别强结合亲和力和有效中和能力的纳米抗体。表位作图显示，尽管Nb1和Nb2的结合位点部分重叠，但它们靶向不同区域：Nb1主要结合RBD的外表面，而Nb2则针对受体结合 motif (RBM)。

3. Results and discussion

3.1. Validation of the use of different labelled perovskite nanomaterials for secondary nanobody

研究人员验证了钙钛矿材料作为系统中信号放大器的使用。通过DPV和SWV结果明显看出，在链霉亲和素-LiSmZrO₃和半胱氨酸-LiSmZrO₃方法中，钙钛矿材料与Nb₂的结合有效提高了免疫传感器对S1的响应。其中链霉亲和素标记的LiSmZrO₃结合给出了最高信号，这归因于链霉亲和素与生物素化Nb₂的强亲和力。

3.2. Electrochemical characterization of the step-by-step fabrication process of the sandwich immunosensor

基于Monama等人报道的钙钛矿材料的形态和电化学特性，LiSmZrO₃有潜力作为夹心型生物传感器构建中的电活性材料。制备步骤包括：首先通过Au-SH相互作用将链霉亲和素固定在AuSPE表面；然后通过强链霉亲和素-生物素亲和力将主要生物素化纳米抗体(Nb₁)有效捕获在AuSPE||strep表面；应用BSA防止纳米抗体降解和阻断非特异性吸附；随后将标记有L-半胱氨酸-LiSmZrO₃的次级纳米抗体(Nb₂)固定在修饰电极表面。

ECL测量显示，AuE||[Ru(bpy)₃]²⁺/TPA系统的电子转移动力学显示出明确界定的ECL信号。当链霉亲和素-硫醇(strep)沉积在电极上时，该ECL信号增强。在修饰了Nb₁后，ECL信号减少，确认了捕获纳米抗体的成功固定化。在用阻断缓冲液(BSA)孵育修饰电极后，修饰电极的电导率降低，ECL信号进一步减少。在与S1连续夹心免疫反应后，ECL信号持续降低，突出了成功的抗原-纳米抗体相互作用。最后，电极与钙钛矿纳米复合材料-生物结合物(Nb₂)孵育，增加了ECL信号。

3.3. Electrochemical verification of the optimized parameters for the sandwich immunosensor

为增强夹心免疫传感器检测S1抗原的能力，研究人员进行了一系列优化实验。峰值电流信号强度与修饰电极上目标分析物浓度直接相关，因为随着S1浓度增加，更多的电子被转移。基于获得的结果，选择10 μg mL^?1 S1作为优化浓度。然后分析了免疫传感器的峰值电流响应强度对抗原-抗体复合物孵育时间的关系，发现在5到60分钟范围内，随着S1孵育时间的增加，峰值电流响应稳步增加。免疫反应时间的最优性被选择为60分钟。

3.4. Immunosensor microscopic characteristics

扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线(EDX)分析提供了裸AuSPE和完全构建的免疫传感器的表面形态和元素组成的比较评估。裸AuSPE的表面呈现光滑均匀，具有未修饰金典型的细颗粒纹理。相比之下，免疫传感器的SEM图像显示了一个高度异质的表面，增加了粗糙度和致密的纳米颗粒样聚集体，表明成功的生物分子固定化和纳米材料整合。EDX分析显示了一个更复杂的元素谱，存在碳、氧、硫、锆和钐，这些归因于生物组分和钙钛矿纳米材料。

3.5. Electrochemical properties of the immunosensor

3.5.1. Sandwich immunosensor scan rate studies

使用CV技术研究了修饰表面电极(AuSPE||strep|Nb₁|BSA|biotin|strep-LiSmZrO₃-Nb₂ + BSA)上S1的化学动力学。结果表明氧化还原峰值电流(Ip)与扫描速率平方根(v^1/2)之间存在线性关系，且氧化还原峰之间的分离增加，表明电子转移受到电活性物种扩散的影响。

3.5.2. Detection of S1 in physiological buffer

在优化条件下，通过评估在不同浓度的S1抗原下的峰值电流响应来评估夹心电化学免疫传感器的分析性能。ECL信号随着S1浓度从0增加到1000 pg mL^?1而逐渐增加。ECL强度与目标分析物浓度之间存在良好的线性关系。使用LOD = 3σ/k和LOQ = 10σ/k公式，获得了ECL的0.04和0.121 pg mL^?1值。

3.5.3. Detection of S1 in real sample

为了确认免疫传感器在这种环境中的有效性，在真实样本(人类血清)中评估了免疫传感器。使用上述LOD和LOQ方程，获得了以下结果：分别为0.38和1.15 pg mL^?1。开发的分析性能显示，在DPBS中比在人类血清中具有更高的灵敏度和更低的LOD和LOQ值。

3.5.4. Comparative studies

这项工作报告了首次开发了一种电化学发光夹心型Nb基免疫传感器，结合了钙钛矿纳米材料标签，用于敏感和选择性检测SARS-CoV-2S蛋白。与其它报道的系统相比，该平台在更复杂的夹心配置中实现了具有竞争力的检测限，代表了识别和转导策略的显著进步。

3.5.5. Control studies to confirm the electrochemical analysis of the immunosensor

使用SWV和DPV分析进行的对照实验验证了开发的夹心纳米抗体基免疫传感器的电化学特性。结果显示，在缺少任何步骤的情况下，会对系统的响应产生显著影响，确认了抗原-抗体免疫复合物的有效形成，并且每个步骤对于免疫传感器的成功制备都至关重要。

3.5.6. Selectivity, reproducibility, and stability studies

高灵敏度和可靠的生物传感器需要具有出色的特异性。除了目标分析物外，一些蛋白质也可能与电极表面的免疫底物相互作用。选择性测试表明，夹心型免疫传感器对目标分析物具有良好的选择性和特异性。长期稳定性测试显示，免疫传感器在4°C黑暗条件下储存25天后，信号衰减较少，保留了超过85%的信号。

4. Conclusion

本研究成功开发了一种高灵敏度和选择性的电化学发光免疫传感器，用于检测刺突(S1)蛋白，这是识别和监测PVR的关键生物标志物。检测残留病毒抗原如S1蛋白的存在对于评估持续感染风险和理解病毒持久性机制至关重要。提出的免疫传感器采用了钙钛矿标记的纳米抗体夹心配置，其中纳米抗体对(Nb1RBDnoCys作为捕获Nb和Nb2RBDNoCys作为检测Nb)提供了对S1抗原的特殊特异性。钙钛矿纳米颗粒的整合放大了电化学信号，产生了适用于PVR定点监测的卓越分析性能。

该电化学发光免疫传感器实现了0.04 pg mL^?1的LOD，展示了优异的灵敏度和可比的分析性能。该生物传感器未显示与谷氨酸、谷胱甘肽、色氨酸和小鼠IgG蛋白等抗原的交叉反应，表明方法具有高选择性，并且在4°C储存25天后仍显示功能正常。

为了进一步提高灵敏度、信号稳定性和简化检测方案，未来的设计可能受益于将检测纳米抗体(Nb₂)直接与辣根过氧化物酶(HRP)偶联。该策略将消除涉及钙钛矿颗粒的中间信号放大步骤，减少背景干扰，并简化制备。此外，HRP-Nb₂结合物可能通过实现更稳健的单步酶信号转导机制来提高重现性并促进更广泛的临床应用。这种优化可能为开发用于快速准确病毒抗原检测的下一代免疫传感器铺平道路。