综述：等离子体工程化界面用于下一代生物传感

本综述创新性地提出将基于单发夹的酶级联四重富集（SH-ECE）系统与CRISPR/Cas12a技术联用，构建了一种用于检测大别山正汉坦病毒（DBSV）的高灵敏度传感平台。该平台通过精巧的探针设计，仅需一个发夹探针（HP）即可在靶基因存在下启动四级循环放大反应，并结合CRISPR/Cas12a的反式切割活性，实现了对低至16.7 fM的DBSV-S-MT1靶标的高特异性检测，甚至能区分单、双、三碱基突变的RNA，为汉坦病毒（HV）感染的早期诊断提供了强大工具。

　　

Materials and reagents

所有寡核苷酸均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。EnGen? Lba Cas12a (Cpf1)、10 × NEBuffer r2.1、Nt. BbvCI 切口内切酶和10 × CutSmart Buffer购自北京NEB公司。脱氧核糖核苷酸（dNTP）混合物、Klenow Fragment (KF) 聚合酶及相应缓冲液均用于实验。

Principle for DBSV-S-MT1 Detection

该传感平台的检测原理如Scheme 1所示。SH-ECE系统的模板发夹探针（HP）包含五个功能区域（Scheme 1A）：靶标/触发链识别域、燃料链结合域、发夹反向杂交域（含回文序列）、切口内切酶识别位点（5'-CCCTC-3'）以及聚合酶延伸域。当靶基因DBSV-S-MT1存在时，其与HP的识别域结合，引发探针构象变化，使回文序列自身杂交形成双链结构。在KF聚合酶和Nt.BbvCI酶的协同作用下，启动第一轮链置换扩增（SDA），释放出模拟靶标链（触发链）和燃料链。触发链可像原始靶标一样与新的HP结合，启动第二轮SDA反应，产生更多的触发链和燃料链，从而实现信号的四级循环放大。产生的燃料链随后激活CRISPR/Cas12a系统：Cas12a/crRNA复合物与燃料链（作为DNA激活剂）结合后，被激活其非特异性切割活性，切割体系中的荧光-淬灭标记的信号探针，产生可检测的荧光信号。这种级联设计显著提高了检测的灵敏度与特异性。

Conclusion

大别山正汉坦病毒（DBSV）对人类健康构成潜在威胁，因此建立一种灵敏、特异且针对DBSV的分子检测方法至关重要。本研究成功构建了一个结合SH-ECE系统与CRISPR/Cas12a系统的传感平台，用于快速、高灵敏度地检测DBSV-S-MT1。尤为突出的是，回文序列的设计使得HP自身可作为引物，无需外源引物，简化了实验操作。此外，该策略具备高灵敏度（检测限达16.7 fM）、优异特异性（可区分碱基突变）以及在实际血清样本中良好的适用性，为基于CRISPR/Cas和SH-ECE系统的检测方法的进一步发展提供了指导与便利。

Ethics approval

人源及鼠源血清样本均取自江西省疾病预防控制中心的生物样本库。样本使用已获江西省疾病预防控制中心伦理委员会批准，并在中国医学研究系统注册（注册号：MR-36-23-036370）。

CRediT authorship contribution statement

文章详细列出了每位作者的贡献：Ziyi Wang（王梓怡）负责初稿撰写、调查与数据分析；Jun Xu（徐俊）参与调查、数据整理与概念构建；Songbai Zhang（张松柏）参与初稿撰写与概念化；Shiwen Liu（刘世文）进行形式分析与数据整理；Suqin Wang（王素琴）参与调查与数据整理；Hongbo Li（李洪博）作为核心贡献者，负责资源获取、方法论、研究调查、资金获取、数据 curation 与概念化，并撰写了初稿与修订稿；Ruqin Yu（俞汝勤）参与了稿件的审阅与编辑。

Declaration of Competing Interest

作者声明不存在任何可能影响本工作报告的已知竞争性经济利益或个人关系。

Acknowledgements

本研究得到了国家自然科学基金（项目号：22164011, 21565015, 21663014）、湖南省自然科学基金（2022JJ30419）、湖南省教育厅科研基金（23A0503）以及化学生物传感与计量学国家重点实验室开放基金（Z2015022）的资助。

作者简介

Ziyi Wang（王梓怡） 是江西师范大学化学与材料学院的硕士研究生，她的研究方向包括基于核酸的生物传感器放大技术以及复杂酶功能的优化。