IL-15受体刺激增强人脐带血NK祖细胞来源的CAR NK细胞生产

本研究揭示通过K562饲养细胞表达膜结合IL-15（mbIL-15）协同4-1BBL与mbIL-21，可显著提升脐带血（CB）来源CD7+CD56?CD34?HLA-DR?Lin? NK祖细胞分化和扩增效率，所产CAR NK细胞在体外及体内实验中均保持强劲抗肿瘤（CD19+ B细胞恶性肿瘤）活性，为通用型NK细胞疗法提供新策略。

　　

Abstract

脐带血（CB）来源的嵌合抗原受体（CAR）自然杀伤（NK）细胞已展现出显著的抗肿瘤功效。近期研究发现，CB衍生的CAR NK细胞主要来源于CB中CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK细胞前体。本研究证实，刺激这些NK前体细胞上的白细胞介素（IL）-15受体可增强从CB细胞生产CAR NK细胞的效率。在CB CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^?细胞中，IL-15受体仅表达于CD7⁺ NK细胞前体。使用不仅表达4-1BB配体和膜结合（mb）IL-21、还表达mbIL-15的K562饲养细胞，可显著增加从纯化的NK细胞前体或T细胞剔除的CB细胞中生产成熟NK细胞的数量。使用表达mbIL-15的K562饲养细胞生成的CAR NK细胞，其体外和体内抗肿瘤效果与使用不表达mbIL-15的K562饲养细胞生产的CAR NK细胞相当。这些结果表明，表达4-1BBL、mbIL-21和mbIL-15的K562饲养细胞可以在保持细胞毒性潜力的同时，增加从CB细胞生产CAR NK细胞的产量。该方法也可能有助于从CB扩增NK细胞，用于任何类型的过继NK细胞疗法，无论是否进行CAR转导。

Introduction

自体抗CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞已在许多B细胞恶性肿瘤患者中诱导缓解。然而，高昂的成本和漫长的静脉到静脉时间是CAR T细胞疗法的关注点。此外，细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等不良反应要求CAR T细胞在专门中心进行给药，进一步限制了这些可能挽救生命的疗法的可及性。因此，人们对开发既更便宜又更安全的现成细胞疗法的兴趣日益增长。

自然杀伤（NK）细胞可以被基因修饰以表达CAR，并且无需人类白细胞抗原（HLA）匹配即可给药，从而允许开发现成的细胞疗法。用抗CD19 CAR和白细胞介素（IL）-15转导的同种异体脐带血（CB）来源的NK细胞已被证明对B细胞恶性肿瘤有效。在这些研究中，CAR NK细胞是通过将T细胞剔除的CB细胞与表达4-1BBL和膜结合（mb）IL-21的K562饲养细胞（K562-4-1BBL-mbIL-21细胞）共培养而产生的。在K562-4-1BBL-mbIL-21饲养细胞中额外表达mbIL-15（据报道在NK细胞分化和增殖中起关键作用）并未增加外周血（PB）NK细胞的扩增潜力。

最近，我们发现CB衍生的NK细胞不仅通过CB中成熟NK细胞的扩增产生。CB衍生的NK细胞主要来源于CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK前体，这表明需要开发从NK前体有效诱导NK细胞分化的方法。

Methods

Cells

CB细胞在获得捐赠者知情同意后，从近畿脐带血库和兵库脐带血库获得。本研究经大阪大学大学院医学系研究科、近畿脐带血库和兵库脐带血库的机构审查委员会批准。K562细胞和Raji细胞购自ATCC和日本研究生物资源细胞银行。

RNA-seq analysis

使用FACS从CB单核细胞（MNCs）中纯化CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^?细胞和CD7^?CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^?细胞，并进行RNA-seq分析。本研究讨论的数据已存入美国国家生物技术信息中心的Gene Expression Omnibus，可通过GEO Series登录号GEO: GSE295031访问。RNA-seq数据集使用BioJupies进行分析。

Generation of the K562-based feeder cells

通过组装GMCSF的信号肽、成熟IL-21、IgG4铰链区和CD4的跨膜结构域来产生膜结合（mb）IL-21。通过组装CD8α的信号肽、成熟IL-15和CD8α的跨膜结构域来产生mbIL-15。通过用4-1BBL、mbIL-15或mbIL-21互补DNA（cDNA）逆转录病毒转导K562细胞（ATCC），建立了K562-4-1BBL-mbIL-21细胞和K562-4-1BBL-mbIL-15-mbIL-21细胞。进行单细胞克隆以建立实验中使用的饲养细胞。

Retrovirus production

为产生瞬时病毒上清液，用Lipofectamine 2000试剂（Thermo Fisher Scientific）将293 T细胞与逆转录病毒载体、gag-pol和VSV-G包膜质粒或pEQ-PAM3(-E)和pRDF共转染。在48和72小时后收集含有逆转录病毒的上清液。pEQ-PAM3(-E)和pRDF质粒分别由东京大学的Toshio Kitamura和富士健康大学的Keiichiro Mihara惠赠。将抗CD19单克隆抗体FMC63的可变区κ轻链和重链的cDNA与CD28、CD3ζ和T2A-IL-15 cDNA融合后插入逆转录病毒载体。

Generation of CAR NK cells

使用CD3 MicroBeads（Miltenyi Biotec）从CB MNCs中剔除T细胞。将T细胞剔除的CB MNCs与经100 Gy照射的K562-4-1BBL-mbIL-21细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞以3:2的比例（CB MNCs:饲养细胞）在补充有10%胎牛血清和20 IU/mL IL-2的RPMI 1640培养基中共培养。1周后，使用RetroNectin（Takara Bio）将携带CD19 CAR-T2A-IL-15 cDNA的逆转录病毒转导到CB衍生的NK细胞中。然后使用经100 Gy照射的K562-4-1BBL-mbIL-21细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞重新刺激细胞，再培养一周。

Flow cytometry and cell sorting

本研究中使用的单克隆抗体（mAbs）列于表S2。使用BD FACS Celesta或FACS Aria II（BD Biosciences）进行流式细胞术和细胞分选，并使用FlowJo软件（BD Biosciences）进行分析。

Cytotoxicity assays

按照先前报道的方法进行⁵¹Cr释放测定。还使用基于流式细胞术的细胞毒性测定法评估CAR NK细胞的细胞毒性，该测定使用表达GFP的Raji细胞作为靶细胞。将靶细胞（1 × 10⁴）与效应细胞以指定的效靶比孵育。

Cytokine release assays

使用ELISA试剂盒（IFN-γ；R&D Systems）测试CD19 CAR NK或对照NK细胞在细胞因子释放测定中的反应性。将效应细胞和靶细胞（各1 × 10⁵个细胞）共培养16小时。共培养在技术重复孔中进行。在稀释至测定线性范围内的培养上清液中测量细胞因子分泌。

In vivo xenograft mouse models

雌性NOG小鼠（In Vivo Science），6-8周龄，在移植前16-24小时用1.0 Gy照射。小鼠通过尾静脉注射2 × 10⁴个Raji-luc/GFP细胞，然后注射1 × 10⁷个CD19 CAR NK细胞或对照NK细胞。在指定时间点，给小鼠腹腔注射VivoGlo Luciferin（Promega，150 mg/kg体重），用异氟烷麻醉，并在活体成像系统上用Living Image软件（PerkinElmer）成像。当小鼠垂死或根据兽医建议（每周监测小鼠两次）时，对小鼠实施安乐死。

Statistical analysis

使用未配对的双尾Student t检验来确定样本之间 statistically significant 的差异。

Results

IL-15 receptor is expressed on CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK progenitor cells but not on the CD7^?CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? cells in human CB

通过荧光激活细胞分选（FACS）从人CB细胞中纯化CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK祖细胞和CD7^?CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^?细胞，并进行RNA-seq分析。在这两个群体之间差异表达的若干基因中，我们发现IL2RB/IL15RB (CD122)和IL2RG (CD132)基因在CD7⁺ NK祖细胞中的表达水平显著高于CD7^?细胞群体。流式细胞术分析显示，CD122在所有CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK祖细胞上表达，但不在CD7^?CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^?细胞上表达。CD132在CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK祖细胞上的表达水平高于CD7^?CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^?细胞。总之，IL-15受体（CD122和CD132的异二聚体）在所有CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK祖细胞上表达，但不在人CB中的CD7^?CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^?细胞上表达。

Yield of human CB-derived NK cells was significantly increased by stimulating the IL-15 receptor expressed on NK progenitor cells

通过用4-1BBL和mbIL-21逆转录病毒转导K562细胞，建立了K562-4-1BBL-mbIL-21细胞，该细胞在多项研究中被用作NK细胞生产的饲养细胞。通过用mbIL-15逆转录病毒转导K562-4-1BBL-mbIL-21细胞，产生了K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞。

从CB单核细胞（MNCs）中通过FACS纯化CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK祖细胞，并与经照射的K562-4-1BBL-mbIL-21饲养细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15饲养细胞在含有IL-2的培养基中共培养。每周补充一次饲养细胞。培养3周后，与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞共培养的大多数细胞变为CD56⁺CD3^? NK细胞，而与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15饲养细胞共培养时，产物中CD56?CD3?细胞的百分比更高。培养21天后，从CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^?Lin^? NK祖细胞（5 × 10³）产生的CD56⁺CD3^? NK细胞的总数，与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞共培养时显著高于与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞共培养时。

将T细胞剔除的CB MNCs与经照射的K562-4-1BBL-mbIL-21细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞在含有IL-2的培养基中共培养。培养3周后，与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞共培养的大多数细胞是CD56⁺CD3^? NK细胞。培养21天后，与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15共培养时，CD56⁺CD3^? NK细胞的扩增显著高于与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞共培养时。此外，在无IL-2的培养基中，与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞培养时，CD56⁺CD3^? NK细胞的扩增远高于与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞培养时。由与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞共培养产生的NK细胞和与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞共培养产生的NK细胞，其NK细胞受体（如CD16、NKG2D、NKp46、NKp30、NKp80和NKG2A）的表达相似。向培养基中添加可溶性IL-15并未增加与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞共培养的CD3^?CB MNCs的NK细胞产量。这些结果表明，通过使用K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞代替K562-4-1BBL-mbIL-21细胞作为饲养细胞，增加了人CB衍生NK细胞的产量。

我们评估了扩增的自然杀伤（NK）细胞在冷冻保存和解冻后的存活率。解冻一天后，用K562-4-1BBL-mbIL-21和K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15饲养细胞扩增的NK细胞的解冻后回收率分别为37.2 ± 16.0%和35.0 ± 12.3%。解冻后的NK细胞保留了其细胞毒性潜力。

Antileukemic potential of CAR NK cells produced by co-culture with K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15 cells was comparable to that produced by co-culture with K562-4-1BBL-mbIL-21 cells.

根据先前报道的方法，使用K562-4-1BBL-mbIL-21细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞作为饲养细胞，从T细胞剔除的CB MNCs产生CD19靶向CAR NK细胞。CD19 CAR的转导效率在两组之间相当。由与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞共培养产生的CD19 CAR NK细胞和由与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞共培养产生的CD19 CAR NK细胞，在与CD19阳性细胞共培养时均发挥细胞毒性并产生干扰素（IFN）-γ，但与CD19缺陷细胞共培养时则不产生。

免疫缺陷小鼠移植了表达荧光素酶的Raji细胞，并用对照（未转导的）NK细胞或CD19 CAR NK细胞治疗，这些CAR NK细胞是使用K562-4-1BBL-mbIL-21细胞或K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞作为饲养细胞从T细胞剔除的CB MNCs产生的。用两种CD19 CAR NK细胞治疗均降低了肿瘤负荷，并显著提高了小鼠的存活率。用使用K562 4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞产生的CD19 CAR NK细胞治疗的小鼠的存活率与用使用K562 4-1BBL-mbIL-21细胞产生的CD19 CAR NK细胞治疗的小鼠的存活率相似。

总之，这些结果表明，使用K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞作为饲养细胞生产的CAR NK细胞显示出与使用K562-4-1BBL-mbIL-21细胞作为饲养细胞生产的CAR NK细胞相当的体外和体内抗肿瘤效果。

Discussion

在本研究中，我们发现IL-15受体在CB中的CD7⁺CD56^?CD34^?HLA-DR^? NK祖细胞上表达，但不在CD7^?CD56^?CD34^?HLA-DR^?非NK祖细胞上表达。据报道，IL-15在NK细胞的分化中具有重要作用。一致地，通过使用表达mbIL-15的K562饲养细胞刺激NK祖细胞上表达的IL-15受体，人CB衍生NK细胞的产量显著增加，而表达在K562饲养细胞上的mbIL-15对从PB-MNCs生产NK细胞没有影响。使用K562-4-1BBL-mbIL-21饲养细胞生成的CAR NK细胞的功效和安全性已在先前的临床试验中得到证明。在我们的实验中，通过与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞共培养产生的CAR NK细胞的抗白血病潜力与那些与K562-4-1BBL-mbIL-21细胞共培养产生的细胞相当。这些结果表明，表达4-1BBL、mbIL-21和mbIL-15的K562饲养细胞可以在保持其细胞毒性潜力的同时，增加从CB细胞生产CAR NK细胞的产量，而通过与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15细胞共培养产生的CAR NK细胞的功效和安全性应在临床试验中仔细检查。

从CD7??CD56?CD34?HLA-DR?Lin? NK祖细胞产生的成熟NK细胞的产量与从T细胞剔除的CB MNCs产生的产量相似。这表明T细胞剔除的CB MNCs可能包含比CD7?? NK祖细胞更早发育阶段的亚群。这个亚群推测是CD34⁺CD7⁺细胞，这在先前的不同培养系统中被报道为NK细胞祖细胞。未来的研究应侧重于从CD34??细胞高效生产NK祖细胞的方法。此外，与K562-4-1BBL-mbIL-21-mbIL-15饲养细胞共培养时，产物中CD56?CD3?细胞的百分比更高，这表明IL-15信号可能不仅扩增成熟NK细胞，还扩增NK祖细胞。未来，我们需要阐明这些CD56^?CD3^?细胞的详细组成。

自然杀伤（NK）细胞的过继转移已成为治疗实体瘤的一种有前景的新方法。与识别MHC复合物中肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）不同，NK细胞靶向MHC表达低或不表达的肿瘤细胞，这使得肿瘤细胞能够逃避CTL攻击。因此，NK细胞疗法可以成为治疗逃避CTL介导的免疫疗法（如免疫检查点抑制剂治疗）的肿瘤的适当补充疗法。我们的结果也可应用于从CB扩增NK细胞，用于任何类型的过继NK细胞疗法，无论是否进行CAR转导。

CAR NK细胞的低解冻后回收率（一个重要问题）无法通过使用表达4-1BBL、mbIL-21和mbIL-15的K562饲养细胞来克服。正如最近报道的那样，在冷冻保存前用IL-18刺激CAR NK细胞可能会增加其解冻后的回收率。

先前的临床试验已经证明了使用K562-based饲养细胞制造的CAR NK细胞的安全性。然而，K562是一种人白血病细胞系。因此，即使细胞在共培养使用前用100 Gy照射，也必须在临床使用前仔细测试CAR NK细胞的残留污染。在不久的将来，我们应该开发一个无饲养系统，例如携带4-1BB、mbIL-15和IL-21的纳米粒子，以解决这个问题。