TILLCANN：大麻EMS诱变平台的构建及其在叶形调控基因CsTCP4功能验证中的应用

本研究针对大麻(Cannabis sativa)遗传资源匮乏的瓶颈，建立了首个标准化EMS化学诱变平台TILLCANN，通过全基因组重测序和靶向测序TILLING-by-Sequencing (TbyS)技术，在1,633个M2家系中成功鉴定出14个功能突变，其中CsTCP4基因突变首次揭示该转录因子对大麻叶片形态建成的调控作用，为作物改良提供了重要遗传资源。

　　

作为集纤维、油脂和药用成分于一体的多功能作物，大麻(Cannabis sativa L.)在工业生产和医疗应用领域展现出巨大潜力。然而由于长期严格的法规限制和定向选育，其遗传多样性严重萎缩，种质资源匮乏已成为制约品种改良的瓶颈。传统育种手段难以快速创制符合特定需求的新种质，特别是在精准调控 cannabinoid（大麻素）合成途径、抗逆性改良等关键农艺性状方面遭遇困境。Targeting Induced Local Lesions in Genomes (TILLING)（靶向诱导基因组局部突变技术）作为一种不引入外源基因的突变体创制策略，在作物遗传改良中具有独特优势，但此前大麻领域尚未建立系统化的诱变平台。

为解决这一技术空白，Duarte-Delgado等研究团队在《Molecular Horticulture》发表了题为"TILLCANN: a TILLING platform in Cannabis sativa for mutation discovery and crop improvement"的研究论文。该工作通过优化甲磺酸乙酯(EMS)诱变条件，构建了包含1,633个M2家系的大麻突变体库，并创新性地结合三维池化建库策略与靶向测序技术，实现了重要农艺性状相关基因的高通量突变筛查。特别值得关注的是，研究者首次发现CsTCP4基因突变与大麻叶片形态建成的直接关联，为理解该转录因子在双子叶植物中的功能保守性提供了新证据。

关键技术方法包括：采用150-250 mM EMS浓度梯度处理杂交后代F₃种子建立突变体库；通过全基因组重测序(WGRS)评估突变频率（平均每个M2植株3,935个纯合突变）；针对13个目标基因设计17个PCR扩增子进行TbyS分析；利用FreeBayes算法进行SNP检测并通过Sanger测序验证；对CsOLS1、CsTCP4和CsMYB106等重要基因开发PACE分子标记用于育种跟踪。

突变体库的构建与表征

通过预浸泡2小时结合150-250 mM EMS处理3小时的优化方案，成功获得具有典型突变表型的M1植株。M2代观察到包括白化、子叶数目异常、叶序紊乱等发育缺陷，证实诱变效果。全基因组重测序显示突变在基因组中分布均匀，但仅3.4%位于可能影响蛋白功能的外显子区域（平均每个基因组134个），凸显了靶向筛查的必要性。

TbyS技术的高效突变检测

研究团队设计覆盖13个目标基因保守区的扩增子（452-704 bp），采用三维池化策略将512个M2家系分成24个混合池进行测序。通过双基因组(cs10和Finola)比对将映射效率提升至94%以上，最终发现20个疑似突变，经Sanger验证确认14个真实突变，检测准确率达82%。计算获得1/320 kb的突变频率，与番茄等作物的诱变平台相当。

关键基因的功能验证

在CsTCP4基因中发现的突变导致BC1M2后代出现显著表型变化：13株突变体表现为三出复叶、叶缘锯齿减少等特征，与野生型的掌状皱叶形成鲜明对比。该突变位于蛋白质卷曲二级结构邻近区域，虽未引起折叠变化，但通过等位基因特异性PCR标记证实其与叶形变异的完全连锁，表明TCP转录因子家族在大麻叶发育中具有重要调控作用。

CsOLS1基因的代谢工程潜力

在参与cannabinoid（大麻素）合成途径的III型聚酮合酶(PKS)家族基因CsOLS1中，研究者鉴定出靠近酶活性位点的功能突变。此前研究表明该位点突变可改变olivetolic acid（橄榄酸）合成效率，本研究发现的突变位点为精准调控cannabinoid含量提供了新靶点，既可用于增强药用成分产量，也可用于工业大麻的THC含量控制。

该研究构建的TILLCANN平台为大麻遗传改良提供了重要资源库，其创新性体现在三方面：首先，标准化诱变流程解决了大麻突变育种的技术空白；其次，三维池化结合TbyS的策略实现了罕见突变的高效挖掘；最重要的是，通过CsTCP4等基因的功能解析，为重要农艺性状的分子机制研究提供了直接证据。尽管突变体存在约3,935个背景突变需要通过回交消除，但平台已储备大量种子资源可用于抗逆筛选。未来该资源将重点服务于cannabinoid谱系优化、开花时间调控、抗病性改良等育种方向，推动工业大麻作为环境友好型作物的可持续发展。