miR-376a-3p通过靶向WWTR1抑制成骨分化：骨折不愈合的新机制与治疗靶点

语 本研究针对骨折不愈合（发生率约10%）的临床难题，通过生物信息学分析发现miR-376a-3p在患者血清中显著上调。机制研究证实miR-376a-3p直接靶向WWTR1（TAZ），抑制人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的成骨分化，降低ALP、Runx2、OSX等关键成骨标志物表达。救援实验验证了miR-376a-3p/WWTR1轴在调控骨修复中的核心作用，为骨折不愈合的早期预测和靶向治疗提供了新思路。

　　

骨折愈合是一个复杂且精细调控的生理过程，涉及多种细胞因子、基因和信号通路的协同作用。然而，约10%的骨折患者会遭遇骨折不愈合的困境，这不仅导致二次手术创伤，还加重了患者的经济负担。当前临床治疗手段如植骨、血小板疗法等虽有一定效果，但侵入性大且疗效有限。近年来，微RNA（miRNA）在骨代谢中的调控作用逐渐受到关注，但其在骨折愈合中的具体机制尚不明确。

本研究聚焦于miR-376a-3p在骨折不愈合中的作用。通过对GEO数据库（GSE125289）的生物信息学分析，研究人员发现miR-376a-3p在骨折不愈合患者中表达显著上调。进一步临床回顾性研究（91例骨折患者血清样本）证实，miR-376a-3p对骨折不愈合的诊断价值较高（AUC=0.846）。机制上，miR-376a-3p通过结合WWTR1（WW domain-containing transcription regulator 1，即TAZ）的3'-非翻译区（3'-UTR），抑制其表达，进而阻碍hBMSCs向成骨细胞分化。

研究采用的关键技术方法包括：生物信息学筛选差异表达miRNA、RT-qPCR验证基因表达、RNA免疫共沉淀（RIP）和双荧光素酶报告实验验证miRNA与靶基因结合、细胞转染（miRNA mimic/inhibitor和过表达质粒）、CCK-8检测细胞活性、ALP/OCN活性测定、救援实验验证通路关系。临床样本来源于秦皇岛市第一医院。

研究结果

1. 生物信息学预测分析

通过分析GSE125289数据集，筛选出4个显著差异表达的miRNA，其中miR-376a-3p差异最显著（|log₂FC|>1.5，p<0.05）。靶基因预测及GO分析显示，WWTR1参与“成骨分化正向调控”，且与miR-376a-3p结合评分高。

2. miR-376a-3p在骨折不愈合患者中高表达

RT-qPCR检测显示，骨折不愈合患者血清中miR-376a-3p表达显著高于愈合组（p<0.01）。ROC曲线分析表明其诊断价值较高（敏感性71.9%，特异性90.6%）。

3. miR-376a-3p靶向调控WWTR1

RIP实验显示，miR-376a-3p mimic组中WWTR1 mRNA富集量显著增加；双荧光素酶报告实验证实miR-376a-3p可直接结合WWTR1的3'-UTR野生型序列（wt），而突变型（mut）结合作用消失。抑制miR-376a-3p后，WWTR1表达显著上升。

4. miR-376a-3p/WWTR1调控成骨分化

过表达miR-376a-3p抑制ALP、Runx2、OSX表达，而过表达WWTR1则促进这些成骨标志物表达。CCK-8实验证实转染未影响细胞活性。救援实验表明，共转染miR-376a-3p mimic和oe-WWTR1可逆转miR-376a-3p对成骨分化的抑制作用。

结论与意义

本研究首次揭示miR-376a-3p通过靶向WWTR1抑制hBMSCs成骨分化，从而参与骨折不愈合的病理过程。这一发现不仅阐明了骨折愈合的新调控机制，还为开发以miR-376a-3p为靶点的早期诊断工具和基因疗法提供了理论依据。未来或可通过抑制miR-376a-3p表达，激活Hippo通路下游效应分子WWTR1，促进骨修复，为骨折不愈合的精准治疗开辟新途径。