pH响应性水凝胶纳米复合物靶向递送紫草素增强骨肉瘤抗PD-L1免疫治疗的研究

《Hormones & Cancer》：PH responsive hydrogel nanocomposites for targeted Shikonin delivery enhance anti PDL1 immunotherapy in osteosarcoma

本研究针对骨肉瘤（OS）对PD-L1抑制剂单药治疗反应率低的难题，构建了pH响应性水凝胶纳米复合物（Gel@PLGA@FA）作为紫草素（Shikonin）的靶向递送平台。研究发现该递送系统能在肿瘤微酸性环境中实现可控药物释放，联合阿特珠单抗（Atezolizumab）可显著下调CDK1和PD-L1表达，抑制细胞增殖并促进线粒体途径凋亡，为骨肉瘤联合免疫治疗提供了新策略。

　　

骨肉瘤是青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有高侵袭性和早期转移的特点。尽管手术和化疗技术不断进步，复发或转移性患者的5年生存率仍徘徊在20%左右，临床迫切需要更有效的治疗策略。免疫检查点抑制剂的出现为实体瘤治疗带来了突破，但PD-L1抑制剂如阿特珠单抗在骨肉瘤中的单药反应率极低，其核心原因在于骨肉瘤被归类为"冷肿瘤"——肿瘤微环境中T细胞浸润稀疏且处于强免疫抑制状态，难以引发有效的免疫应答。

紫草素是从传统中药紫草中提取的天然萘醌化合物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性。特别值得注意的是，它能够通过下调TGF-β等免疫抑制因子，调节CD8⁺T细胞与Treg细胞的比例来改善肿瘤微环境，显示出联合免疫治疗的潜力。然而，其水溶性差和对正常细胞存在一定毒性的缺点限制了临床应用。

近年来纳米技术的发展为肿瘤联合治疗提供了新思路。pH响应性水凝胶纳米复合物因其独特的肿瘤微环境响应能力、良好的生物相容性和可控的药物释放特性，被广泛应用于靶向给药系统。这类材料能够在肿瘤组织的酸性微环境中触发结构变化，实现药物的定点释放，从而提高治疗效率并减少全身毒性。

为克服紫草素的临床应用瓶颈，Chen等研究人员在《Discover Oncology》上发表了最新研究成果，构建了一种pH响应性水凝胶纳米复合物（Gel@PLGA@FA）作为紫草素的递送平台，旨在通过靶向递送和可控释放来增强紫草素对骨肉瘤的免疫调节作用，从而提高阿特珠单抗的治疗效果。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过GEO数据库（GSE14359数据集）筛选紫草素靶向骨肉瘤的差异表达基因并构建预后风险模型；利用分子动力学模拟评估紫草素与CDK1的结合能力；采用乳化-溶剂挥发法制备PLGA纳米颗粒并偶联叶酸（FA）构建靶向递送系统；通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）表征材料形貌；使用CCK-8、EdU、流式细胞术和JC-1染色等实验评估体外抗肿瘤效果。

紫草素靶向骨肉瘤的差异基因筛选

通过对GSE14359数据集的分析，研究人员发现紫草素靶向基因与骨肉瘤差异表达基因存在28个重叠基因。蛋白互作网络分析显示CDK1、PIK3R1和PDGFRB是关键的枢纽蛋白。GO功能富集分析表明这些基因主要参与"钙稳态"和"ERK1/ERK2级联"等生物过程，KEGG通路分析显示它们显著富集于"EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药"和"Rap1"等信号通路。

构建紫草素靶向骨肉瘤预后模型

通过LASSO回归模型筛选出四个关键基因（SCD、CCR2、NR3C2、CDK1）构建风险评分模型。Kaplan-Meier生存曲线显示高风险组患者中位生存时间显著缩短。列线图预测模型在1、3、5年生存率预测中表现出良好的准确性。

紫草素靶向治疗骨肉瘤关键靶点的临床特征

CDK1在多种癌症类型中显著过表达，在骨肉瘤转移患者中表达上调，且与肿瘤残留状态相关。免疫浸润分析显示CDK1高表达组中活化NK细胞、M1巨噬细胞和活化树突状细胞比例增加，表明CDK1可能通过促进某些免疫细胞类型的活化来调节免疫微环境。

紫草素与CDK1分子的相互作用

分子动力学模拟结果显示，紫草素与CDK1表现出强大的结合能力：复合物构象稳定、结构稳定性增强、原子波动性降低、整体结构紧凑、表面暴露减少、存在持续的氢键作用、二级结构未发生显著改变、残基能量贡献显著且处于低能态，这些发现为深入理解紫草素与CDK1的分子相互作用机制提供了重要依据。

紫草素对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用和毒性评估

紫草素对MG63和Saos-2骨肉瘤细胞表现出显著的抗增殖作用，IC₅₀值分别为1.73μM和1.38μM。虽然对正常肝细胞（L-02）、肾小管上皮细胞（HK-2）和成骨细胞（hFOB1.19）也显示一定细胞毒性，但其IC₅₀值（5.69μM、10.28μM和6.16μM）远高于对骨肉瘤细胞的值，表明紫草素对癌细胞具有选择性毒性。

含紫草素的pH响应智能水凝胶纳米材料复合物的合成

成功合成了负载紫草素的pH响应智能水凝胶纳米材料复合物（Gel@PLGA@FA）。动态光散射（DLS）显示PLGA纳米颗粒平均直径约为72纳米，负载紫草素后粒径增至91.6纳米，叶酸修饰后进一步增至132纳米。Zeta电位分析表明叶酸修饰增强了纳米颗粒表面的负电性（-44.35mV）。扫描电镜显示复合材料具有多孔内部结构，纳米颗粒均匀分布且呈光滑球形。pH响应药物释放曲线显示，在pH5.0条件下紫草素释放最快，表明该复合材料可在肿瘤微环境（低pH）中实现可控药物释放。

pH响应水凝胶纳米材料复合物的靶向摄取能力和毒性评估

叶酸修饰的纳米颗粒（Gel@PLGA@DiO@FA）在Saos-2细胞中的摄取效率显著高于未修饰组。毒性评估显示，即使在高浓度（200μM/mL）下，该复合材料对正常肝上皮细胞、肾小管上皮细胞和成骨细胞的存活率仍保持在90%以上，表明其具有良好的生物安全性。

负载紫草素的pH响应水凝胶纳米材料复合物增强骨肉瘤抗PD-L1治疗效果

Gel@PLGA@Shikonin@FA能显著降低Saos-2和MG63细胞中CDK1和CD279（PD-1）的mRNA表达水平。与阿特珠单抗联合使用时，对CDK1表达的抑制作用进一步增强，并显著抑制骨肉瘤细胞增殖。流式细胞术分析显示，联合治疗组Saos-2细胞凋亡率增至33.45%，显著高于DMSO对照组（2.17%）和各单药治疗组。

JC-1染色实验进一步证实，联合治疗能有效扰乱骨肉瘤细胞线粒体膜电位，绿色荧光强度显著高于其他组，红色荧光明显减少，表明线粒体膜电位大量丧失，细胞凋亡被强烈诱导。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次将紫草素封装到肿瘤靶向的pH响应纳米载体中，专门用于增强PD-L1抑制剂在骨肉瘤中的疗效。与传统的游离药物给药相比，该纳米平台显著提高了紫草素的生物利用度和肿瘤靶向性。分子动力学模拟结果表明紫草素与CDK1具有强而稳定的结合能力，为紫草素作为靶向CDK1的治疗剂提供了分子基础。

通过成功构建pH响应性水凝胶纳米复合材料Gel@PLGA@FA，实现了紫草素在肿瘤微环境中的可控释放，有效增强了抗肿瘤免疫应答，并与阿特珠单抗产生协同效应，在骨肉瘤模型中实现了优异的肿瘤抑制效果和延长的生存时间。重要的是，与游离紫草素相比，该递送系统显著降低了毒性。

该研究不仅揭示了紫草素作为潜在抗癌药物的独特作用机制，也证明了pH响应性水凝胶纳米材料复合物作为靶向癌症治疗的高效安全递送系统的潜力。这些发现为通过靶向给药系统联合免疫治疗来改善骨肉瘤治疗提供了坚实的实验依据和创新策略。未来研究将进一步完善该复合物的设计，为骨肉瘤患者带来新的希望。