乳酰化修饰与孟德尔随机化整合分析揭示RLF和SMCHD1作为心肌梗死代谢-免疫串扰的因果治疗靶点

本综述通过整合乳酰化组学与多组学分析，首次发现RLF和SMCHD1是心肌梗死（MI）的因果风险基因（AUC分别达0.823/0.809）。研究结合孟德尔随机化（MR）与实验验证，揭示二者通过调控核苷酸代谢、HIF-1/MAPK信号通路和免疫细胞浸润（单核细胞/中性粒细胞活化及CD8+ T细胞抑制）介导代谢-免疫失调，为MI诊断和靶向治疗提供新策略。

　　

1 引言

心肌梗死（MI）全球年死亡人数超过700万，尽管血运重建和药物治疗取得进展，但其早期诊断仍高度依赖高灵敏度心肌肌钙蛋白（hs-cTnT/I），这些标志物特异性有限，常延误有效风险分层并加剧梗死后并发症。代谢-免疫失调通过促进致命性心脏重构成为这些并发症的关键驱动因素。然而，MI进展过程中代谢重编程与免疫激活间的分子相互作用仍不明确。虽然转录组学已鉴定出大量MI相关差异表达基因（DEGs），但其功能意义及与临床表型的因果关系大多未经验证，阻碍了治疗转化。

翻译后修饰（PTMs）在心血管病理中的重要性日益凸显，加剧了这一认知空白。乳酰化是一种代谢物敏感的PTM，通过乳酸-HIF1α信号轴将糖酵解通量与炎症反应联系起来。该修饰在肿瘤学和免疫学中作为关键调节因子已确立作用，但其对MI相关基因的影响，尤其是那些调控代谢-免疫串扰的基因，仍 largely unexplored。

越来越多证据表明乳酰化修饰蛋白是MI发病机制的关键 orchestrate。Chuanfu等人发现乳酸诱导心肌梗死后心脏内皮细胞中Snail1的乳酰化。此外，Zhang等人报道心脏代谢通过α-MHC乳酰化修饰直接调节肌节结构和功能，从而影响心脏结构和性能。尽管人类MI的转录组研究 consistently 显示能量代谢和免疫特征的失调，但先前尚无研究将乳酰化组学与因果推断方法整合以识别因果调节因子。传统的DEG分析无法建立因果关系，独立的PTM研究缺乏临床相关性的稳健遗传验证。因此，两个关键问题阻碍了进展：哪些乳酰化相关DEG对MI风险有因果贡献？这些基因如何同时介导代谢功能障碍和免疫微环境重塑？

孟德尔随机化（MR）通过利用遗传变异作为工具变量为解决这些问题提供了强大方法。然而，在心血管研究中，乳酰化蛋白质组学、多队列转录组学和MR的整合尚未实现。这一方法学差距严重阻碍了治疗发现。具体而言，有效的MI干预需要既得到遗传学因果支持，又在代谢-免疫通路中发挥双重调节功能的目标——这些属性无法通过单组学策略验证。没有整合框架，乳酰化相关差异表达基因（lactylation-DEGs）的诊断和治疗潜力仍未被开发。

为弥补这些差距，我们开发了一个整合的乳酰化-MR框架，分析了三个MI转录组队列（共73例患者和67例对照）。我们通过整合乳酰化蛋白质组学、DEG筛选和MR分析，鉴定了因果MI风险基因，并通过实验验证了它们在代谢-免疫失调和免疫微环境动力学中的作用。本研究确立RLF和SMCHD1为乳酰化修饰的MI发病机制的因果调节因子，证明了它们的诊断和治疗潜力。

2 材料与方法

2.1 数据收集

从基因表达综合（GEO）数据库检索与搜索词“myocardial infarction”和“Homo sapiens”匹配的人类基因表达数据集。纳入标准要求：每个队列≥10个样本；≥5例MI患者和5例健康对照；无化学/遗传干预；可获得原始数据或标准化表达矩阵。三个数据集（GSE60993、GSE61144、GSE66360）满足这些标准，共73例MI患者和67例对照。

2.2 DEG鉴定

数据在R（v4.4.2）中使用limma包进行背景校正和分位数归一化分析。通过主成分分析（PCA）调整批次效应。差异表达分析采用经验贝叶斯调节线性模型（P < 0.05，|log₂FC|>0.585），鉴定出571个DEGs。

2.3 LRGs

乳酰化相关基因（LRGs）从现有文献和公共数据库（如PubMed和GeneCards）系统整理，使用搜索词“lactylation”。此过程鉴定出2051个LRGs。随后的DEGs与LRGs的交叉分析揭示了56个乳酰化相关DEGs。

2.4 MR分析

工具变量（IVs）选择为与乳酰化相关DEG表达显著相关的遗传变异（P < 5 × 10^?6），来自Gene eQTL consortium。连锁不平衡（LD） clumping 确保IV独立性（r² < 0.001，距离 = 10,000 kb）。F统计量<10的IVs被排除为弱工具，产生42,699个SNPs。结局数据方面，MI全基因组关联研究（GWAS）摘要统计数据来自：ebi-a-GCST011365（14,825例病例/44,000例对照，欧洲血统）、ieu-a-798（43,676例病例/128,199例对照，欧洲血统）和ebi-a-GCST90018877（20,917例病例/461,823例对照，欧洲血统）。主要分析使用逆方差加权（IVW）回归。敏感性分析采用MR-Egger、加权中位数和简单模式方法。通过MR-Egger截距评估多效性（P > 0.05表明稳健性）。

2.5 功能富集

56个乳酰化相关DEGs的功能富集分析使用R包clusterProfiler（v4.0）进行，检查基因本体（GO）术语（生物过程、分子功能、细胞成分）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路。显著性定义为FDR调整后P < 0.05。基因集变异分析（GSVA）评估了RLF/SMCHD1高表达（≥70百分位数）与低表达（≤30百分位数）组之间的通路活性差异，与原始研究的分层一致。

2.6 免疫细胞浸润

MI组织中的免疫细胞分数通过CIBERSORT（v1.03）使用默认LM22特征矩阵量化。Spearman等级相关分析评估log₂转换的RLF/SMCHD1表达水平与22个免疫细胞亚群比例之间的关联，统计学显著性定义为P < 0.05。

2.7 MI建模—LAD手术

20只8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重20–25 g，随机分为MI组（n = 10）和假手术组（n = 10）。小鼠饲养在安静、温度控制（22 °C–24 °C）的环境中，12小时光/暗循环。C57BL/6小鼠用2%异氟烷麻醉。在第四肋间开胸暴露心脏。左前降支冠状动脉（LAD）在其起源远端约3 mm处用6–0丝线结扎。缝针插入深度约1.5 mm。通过观察结扎部位远端心肌组织变白确认成功闭塞。假手术组，左前降支冠状动脉插管但不结扎，确保所有其他手术程序统一执行。最后，通过依次缝合肌肉层关闭胸腔。

2.8 定量实时PCR

使用TRIzol试剂从血浆样本提取总RNA。每个样本，1 μg总RNA使用Hifair? III第一链cDNA合成SuperMix反转录成cDNA。随后使用Power SYBR? Green PCR Master Mix进行定量实时PCR（qPCR），遵循制造商说明。使用的引物序列如下：LRF：正向：5′-CTGTTGCTAAAGGAAATCTGTGC-3′；反向：5′-ACAGTTCTGTAATGGCGAATCAG-3′。SMCHD1：正向：5′-GATGGCCTTGACAGCTCAAAC-3′；反向：5′-CGCCAAGTAAAACACAGATCCTT-3′。β-肌动蛋白（内参）：正向：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；反向：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。使用2^?ΔΔCT方法计算相对mRNA表达水平并归一化至β-肌动蛋白。

2.9 Western blotting

通过Western blotting分析小鼠血清样本中RLF和SMCHD1蛋白表达。每个样本等量总蛋白通过SDS-PAGE分离，随后转移到PVDF膜上。室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时后，膜在4 °C overnight 与以下一抗孵育：抗-RLF、抗-SMCHD1和抗-转铁蛋白（Transferrin）。充分洗涤后，膜与适当的辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗在室温孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）底物可视化蛋白条带，并使用凝胶成像系统检测/分析。

2.10 统计方法

所有数据表示为平均值±标准差（SD）。在确认正态性（Shapiro-Wilk检验，P > 0.05）和方差齐性（Levene检验，P > 0.05）后，使用未配对双尾Student t检验进行Sham组和MI组之间的统计比较。对于非正态分布数据，应用Mann-Whitney U检验。显著性定义为P < 0.05。所有分析在SPSS 26.0中进行，并使用GraphPad Prism 9.0可视化。显著性阈值定义如下：P < 0.001, * P < 0.01, * P < 0.05, ns（不显著）表示P ≥ 0.05。

3 结果

3.1 数据整合与DEG筛选

从GEO数据库检索三个MI微阵列数据集作为实验队列，共包括73例MI患者和67例健康对照。

表达值使用R（v4.4.2）处理合并，批次效应通过PCA校正。校正前PCA显示数据集间存在显著批次效应，而校正后实现了同质性。差异表达分析按P值升序排列基因（较低值表示较高置信度），鉴定出571个显著DEGs。按统计学显著性排名的前50个DEGs的热图如图所示。

3.2 乳酰化相关基因鉴定

从文献和数据库共整理2051个LRGs。DEGs与LRGs的交叉分析鉴定出56个重叠基因，指定为乳酰化相关DEGs。通过MR分析在三个预定义筛选标准下，我们确立RLF和SMCHD1为在MI患者中显著升高的因果风险基因。关键的MR分析——包括留一法敏感性分析、遗传关联散点图和合并IVW估计的森林图——视觉确认了RLF和SMCHD1对MI风险的稳健因果效应。RLF定位于染色体1，SMCHD1定位于染色体18。受试者工作特征（ROC）曲线显示两个基因具有高诊断准确性（RLF: AUC = 0.823; SMCHD1: AUC = 0.809）在区分MI患者与对照方面。

3.3 乳酰化-DEGs的功能富集

使用GO和KEGG通路对56个乳酰化修饰的差异表达基因（DEGs）进行功能富集分析。GO分析显示在生物过程中显著富集，包括前体代谢物和能量生成、核糖磷酸代谢、免疫反应中的白细胞/细胞激活以及核苷酸代谢。KEGG分析揭示主要与坏死性凋亡、核苷酸代谢和HIF-1信号通路相关。GSVA显示RLF高表达队列表现出甲状腺癌、视黄醇代谢、背腹轴形成、黑色素瘤、2型糖尿病、细胞色素P450介导的外源物代谢、神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号、色氨酸代谢和肾素-血管紧张素系统通路的显著上调，同时丙酸代谢、蛋白酶体功能、蛋白输出、过氧化物酶体活性、磷酸戊糖途径、嘌呤代谢、硫酸软骨素糖胺聚糖生物合成、原发性免疫缺陷、N-聚糖生物合成和同源重组下调。对于SMCHD1高表达队列，显著上调的通路包括凋亡、B细胞受体信号、RIG-I样受体信号、趋化因子信号、利什曼原虫感染反应、长时程增强、NOD样受体信号、自然杀伤细胞毒性和Toll样受体信号以及神经营养因子信号，而下调通路包括ECM-受体相互作用、嗅觉转导、基底细胞癌、糖酵解/糖异生、乙醛酸和二羧酸代谢、Hedgehog信号、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、细胞色素P450介导的外源物代谢、苯丙氨酸代谢和酪氨酸代谢。关键的是，细胞色素P450介导的外源物代谢显示反向调节——在RLF高表达队列中上调而在SMCHD1高表达队列中下调。

3.4 MI中免疫细胞浸润评估

MI中靶基因的功能和通路分析揭示了与代谢和免疫过程的密切关联。因此，我们采用CIBERSORT算法推断免疫细胞特征并探索MI靶基因与免疫细胞浸润之间的相关性。图A说明了所有样本中22种免疫细胞类型的比例。与对照相比，MI患者样本表现出显著升高的活化CD4⁺记忆T细胞、静息NK细胞、单核细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞水平，同时CD8⁺ T细胞、静息CD4⁺记忆T细胞和γδ T细胞水平减少。此外，与22种免疫细胞类型的相关性分析表明，靶基因RLF与活化树突状细胞、中性粒细胞和单核细胞正相关，但与CD8⁺ T细胞和静息CD4⁺记忆T细胞负相关。SMCHD1显示与活化树突状细胞、中性粒细胞和活化CD4⁺记忆T细胞正相关，同时与滤泡辅助T细胞和调节性T细胞（Tregs）负相关。值得注意的是，活化树突状细胞和中性粒细胞与RLF和SMCHD1均正相关。

3.5 验证队列中的差异分析

MR分析显示MI组中RLF和SMCHD1表达较对照显著升高。使用GSE61145队列的验证证实RLF表达在MI样本中显著高于对照（P < 0.05），与我们的MR发现一致。尽管SMCHD1表达在MI组相对于对照升高，但此差异未达到统计学显著性。

3.6 小鼠MI模型中RLF和SMCHD1失调的验证

在小鼠MI模型中，血清RLF表达在mRNA和蛋白水平均较假手术对照显著升高（P < 0.0001）。WB分析证实MI血清中RLF蛋白表达增加，定量数据显示显著上调。SMCHD1表达在mRNA（P = 0.0051）和蛋白水平（P = 0.0289）在MI组均显示上升趋势。

4 讨论

4.1 核心发现的重述与创新

本研究开创性地将乳酰化组分析与MR整合，确立RLF和SMCHD1为MI的因果风险基因。通过筛选三个MI转录组数据集（73例患者 vs. 67例对照）中鉴定出的571个DEGs，并将其与2051个LRGs交叉，我们获得了56个乳酰化相关DEGs。随后的MR分析（利用42,699个F统计量>10的工具SNPs）确认了RLF（AUC = 0.823）和SMCHD1（AUC = 0.809）的因果效应和诊断价值。功能研究揭示这两个基因协同驱动代谢失调（影响核苷酸代谢和HIF-1/MAPK信号）和免疫细胞浸润（以单核细胞/中性粒细胞活化和CD8⁺ T细胞抑制为特征），突出了乳酰化在代谢-免疫串扰中的核心作用。此多组学因果推断框架为心血管靶点发现提供了新范式。

4.2 RLF的机制与病理意义

RLF编码Zn-15家族的锌指蛋白（也称为ZN-15L或ZNF292L），通过其锌指结构域结合特定DNA序列调节基因转录。它可以激活或抑制靶基因表达，从而影响基本细胞过程如增殖、分化和凋亡。RLF表达失调或该基因突变可破坏细胞周期控制并可能促进肿瘤发生。此外，改变的RLF表达水平在神经退行性疾病中有报道，提示在神经保护和修复中的潜在作用。RLF通过两种 distinct 机制加剧MI损伤：代谢失调：RLF激活MAPK信号通路，该通路涉及甲状腺癌和视黄醇代谢，以及细胞色素P450介导的外源物代谢，导致缺血心肌中的能量应激和氧化损伤。免疫重编程：RLF与单核细胞和中性粒细胞浸润正相关，与CD8⁺ T细胞和静息CD4⁺ T细胞负相关， fostering 促炎微环境。在心血管系统内，RLF的功能作用 largely 未定义。本研究首次将RLF识别为代谢-免疫串扰的关键节点。机制上，其锌指结构域可能结合乳酰化组蛋白如H3K9la，放大HIF-1α介导的糖酵解-炎症正反馈环， thereby 加速梗死区内的坏死性凋亡。这得到坏死性凋亡通路富集分析的支持。

4.3 SMCHD1的机制及其与RLF的协同作用

SMCHD1是一个大的多结构域蛋白，属于SMC超家族。作为正常发育必需的关键表观遗传修饰剂，SMCHD1参与基因沉默。SMCHD1基因中的错义突变损害其基因沉默能力，并可能 underlie Bosma无鼻小眼综合征（BAMS）。此外，SMCHD1通过结合病毒裂解起源和抑制复制复合物限制疱疹病毒复制；SMCHD1突变通过异常基因沉默导致面肩肱型肌营养不良2型（FSHD2）。我们在MI中的GSVA揭示了SMCHD1介导的双重调节机制。首先，该锌指蛋白通过上调B细胞受体信号、Toll样受体（TLR）/NOD样受体通路和中性粒细胞介导的细胞毒性促进促炎激活——与其在放大先天免疫反应中的作用一致。其次，它通过抑制细胞色素P450介导的外源物代谢（ notably 通过CYP3A4下调）展示 contrasting 代谢调节，此功能直接 opposed RLF的增强效应。这种代谢-免疫双重性提示组织特异性表观遗传重编程，其中SMCHD1同时执行两种 distinct 功能：通过染色质修饰沉默代谢基因，和在缺血心肌细胞中激活炎症转录程序。代谢通路协同抑制 alongside 免疫激活揭示了缺血损伤期间细胞能量学与炎症反应之间的新颖机制联系。

4.4 代谢免疫串扰的临床转化价值

单核细胞表现出表型可塑性，在MI后病理中扮演双重角色。心肌组织坏死导致损伤相关分子模式（DAMPs）释放，如高迁移率族蛋白1（HMGB1）， initiates 单核细胞浸润。这些单核细胞随后分化为 distinct 巨噬细胞亚群：M1促炎（以CCR2+CD86⁺标记为特征）和M2修复（以CX3CR1+CD206+标记为特征）。M1巨噬细胞通过IL-1β/TNF-α分泌加剧组织损伤，而M2对应物通过TGF-β/IL-10 production 促进纤维化修复。我们的发现表明RLF过表达显著增强单核细胞招募（r = 0.42, p < 0.01），可能通过MAPK通路和CCL2/CCR2轴激活介导。相比之下，SMCHD1对抗炎基因（如IL10）施加表观遗传抑制， thereby 延迟向M2巨噬细胞表型的极化。治疗上，调节RLF-SMCHD1轴 enables 阶段特异性干预：急性期RLF抑制减弱M1极化，而修复期SMCHD1阻断促进M2介导的组织恢复。

中性粒细胞在MI发病中表现出时间 divergent 作用。早期阶段（梗死后6–24小时），中性粒细胞浸润通过NETosis介导的髓过氧化物酶（MPO）释放加剧心肌损伤，放大氧化应激。相反，表型转变发生在72小时，中性粒细胞采用N2修复亚型，以乳铁蛋白和脂氧素A4（LXA4）分泌为特征， facilitates 炎症消退。我们的发现证明RLF和SMCHD1的协调调节，它们协同上调中性粒细胞趋化因子CXCL1/CXCL8，与浸润强度 strongly 相关（r > 0.38, p < 0.01）。值得注意的是，代谢串扰分析揭示功能拮抗：RLF激活而SMCHD1抑制细胞色素P450通路，可能通过受损的活性氧（ROS）清除破坏氧化还原稳态。RLF-SMCHD1轴的 therapeutic 调制 emerge 作为有前景的策略以减轻早期中性粒细胞介导的细胞毒性同时保留其后期修复功能。

CD8⁺ T淋巴细胞在MI发病中表现出功能 dichotomy，细胞毒性（CD8⁺CD57⁺）和调节性（CD8⁺CD28^?）亚群扮演 opposing 角色。细胞毒性群体通过IFN-γ和颗粒酶B分泌加剧心脏损伤，直接诱导心肌细胞死亡和不良结局。相反，调节性CD8⁺ T细胞通过PD-1/CTLA-4检查点信号减弱炎症级联同时促进组织修复。我们的机制研究证明RLF介导的总CD8⁺ T细胞浸润抑制（r = ?0.31, P < 0.05），可能通过MHC-I下调可能损害抗纤维化监视。显著地，由RLF转录驱动的MAPK通路 hyperactivation 上调T细胞耗竭标记，如TIM-3， thereby 优先扩增致病性CD57⁺亚群。此双重调节机制将RLF定位为缺血心肌内CD8⁺ T细胞功能极化的 pivotal 调节因子。

组织驻留记忆CD4⁺ T细胞（Trm）作为抗原特异性免疫记忆库，在MI复发时迅速激活并招募巨噬细胞。我们的发现提示SMCHD1介导的表观遗传沉默可能抑制组织驻留记忆T细胞（Trm）的关键存活基因，如BCL2， thereby 损害免疫记忆。临床上，Trm频率降低与MI后心脏破裂风险增加相关，为靶向SMCHD1的治疗干预提供了理论基础。

4.5 研究局限性与未来方向

我们的整合方法结合了乳酰化组分析、多队列转录组学和MR分析，解决了单组学研究固有的显著局限性，如相关性推断偏倚。然而，几个挑战仍需进一步研究。从技术角度看，组织数据源的异质性——如外周血与循环内皮细胞——可能模糊心肌特异性乳酰化靶点。为解决此问题，未来研究应利用单细胞乳酰化组测序以阐明各种梗死区细胞亚型（包括CD206⁺修复巨噬细胞和心脏成纤维细胞）的修饰景观， thereby 定义RLF/SMCHD1的细胞类型特异性功能。关于人群偏倚，MR分析依赖欧洲来源的遗传工具（42,699 SNPs），由于种族间连锁不平衡变异可能限制普适性。在多族裔队列（东亚、非洲）中的验证对于确认靶点因果性至关重要。关键机制 gaps 持续存在：RLF/SMCHD1蛋白的直接乳酰化需要通过使用位点特异性抗体（如抗-RLF-Kla）结合质谱来验证，以准确绘制修饰位点并评估其动力学；RLF/SMCHD1在梗死阶段（促炎急性期 vs. 促纤维化修复期）的时间调节仍未表征。我们推荐生成心脏特异性条件敲除模型进行时间分辨转录组和乳酰化组分析以描绘阶段依赖性功能。

理论上，我们提出乳酰化作为一种 novel “代谢-免疫检查点”：乳酸积累通过RLF/SMCHD1修饰同步驱动代谢应激和免疫失衡。临床转化应分阶段进行：短期将RLF/SMCHD1与 established 生物标志物（如SAT1和PYGL5）整合有潜力开发适用于多中心诊断框架的乳酰化-DEG通路图。长期策略应开发靶向调节剂——设计针对RLF的锌指结构域抑制剂和采用溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）用于SMCHD1降解。

5 结论

本研究通过先进的生物信息学和统计方法对MI进行了深入分析，鉴定了具有高特异性的关键基因和通路。我们强调了免疫细胞和遗传决定因素在MI发病中的 pivotal 作用，RLF和SMCHD1 emerge 作为主要分子靶点。这些发现不仅阐明了MI underlying 的复杂分子机制，而且为 novel 治疗干预开辟了途径。 collectively，我们的研究对理解MI病理生理学贡献 significantly 并 underscore 了未来治疗开发中向靶向分子和免疫调节策略的范式转变。