靶向下一代测序技术应用于支气管肺泡灌洗液样本诊断肺部感染：一项单中心回顾性研究的临床价值与意义

本综述系统评估了靶向下一代测序（tNGS）技术在肺部感染（PIs）病原诊断中的临床应用价值。研究表明，与传统微生物检测（CMTs）和培养方法相比，tNGS具有更高的敏感性和准确性，尤其在混合感染、细菌、非典型病原体和病毒检测方面表现突出。该技术显著影响了近半数患者的临床治疗方案调整，可作为CMTs的重要补充，推动肺部感染的精准诊疗。

　　

引言

下呼吸道感染在全球范围内导致高发病率和高死亡率。由于病原体种类繁多，快速准确地检测目标病原体并进行精准抗感染治疗一直是临床实践中的主要挑战。常规微生物学检测（CMTs）虽然涵盖多种方法，但仅能识别约40%的病原体，且存在一系列局限性。传统的染色和培养技术仍广泛用于常见病原体的检测，但这些方法存在灵敏度低、培养周期长以及对某些病原体需要严格或困难的培养条件等缺点。聚合酶链反应（PCR）及其衍生技术、基因芯片技术和免疫测定等分子方法已成为诊断肺部感染（PIs）的主要方法，但这些方法需要假设诊断，通常仅限于检测特定病原体类别，检测范围窄，且容易产生潜在的假阴性结果。因此，传统的病原体诊断方法不足以满足临床实践的需求。

宏基因组下一代测序（mNGS）近年来成为一种新型病原体诊断技术。该方法检测时间短、检测范围广，能够精确识别各种病原体，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫，这些能力相比传统检测方法有显著改进。尽管该技术可以同时检测约20,000种不同类型的微生物，但其复杂性和高成本限制了其常规临床使用，阻碍了其广泛推广和应用。

靶向下一代测序（tNGS）最近被开发用于识别临床环境中最普遍的病原体类型。这种先进技术利用一组预先设计的多重病原体引物（多重PCR）结合高通量测序技术来识别病原体。高度多重PCR作为tNGS工作流程的一部分，代表了一种成本效益高且快速的分子检测方法；然而，其灵敏度低于更高通量的mNGS。通过整合这两种方法的优势，tNGS能够实现更准确、更高效的病原体检测。除了表现出增强的灵敏度外，这种方法显著缩短了周转时间（低至14.5–16小时）和检测成本（mNGS的四分之一到二分之一），从而减轻了患者的经济负担。一项关于血流感染（BSIs）的研究表明，血液tNGS诊断BSIs的灵敏度显著高于血培养（91.3% vs. 23.2%）和mNGS（91.3% vs. 69.6%）。另有研究报告称，tNGS对中枢神经系统感染的诊断灵敏度显著高于常规脑脊液培养和涂片（81.8% vs. 13.6%）。另一项涉及成年血液系统恶性肿瘤和疑似感染患者的研究表明，通过tNGS使用多种标本类型进行病原体检测的灵敏度（69.7% vs. 35.9%）、阴性预测值（NPV）（48.2% vs. 42.4%）和准确性（66.5% vs. 56.5%）均显著高于CMTs。在一项评估130例重症肺炎的研究中，tNGS结果与临床诊断的一致性超过70%，并且tNGS检测到的病原微生物与培养、mNGS和实时定量PCR结果一致。此外，在特定的呼吸道样本中，tNGS对病原体表现出高检测灵敏度，并保持高灵敏度（70.8%–95.0%）。

目前，描述其诊断PIs中多种病原体价值的报告有限，特别是在诊断特异性方面缺乏或缺乏代表性数据。此外，确定检测到的微生物的致病潜力也很困难。因此，在本研究中，我们回顾性分析了110例疑似PIs患者支气管肺泡灌洗液（BALF）样本的tNGS结果，以评估其与传统方法相比的诊断准确性和临床价值。

材料与方法

患者

回顾性分析了2023年2月至2025年1月期间在福建中医药大学附属人民医院接受tNGS检测的患者数据。纳入标准如下：（1）年龄≥18岁；（2）初步诊断为PIs的患者；（3）具有进行过tNGS DNA和RNA检测以及CMTs的BALF样本的患者。排除标准如下：（1）诊断不明确；（2）非BALF标本；（3）tNGS检测标本质量控制不合格；（4）医疗数据不完整。

PIs和非PIs的诊断标准通过综合临床分析确定，结合了症状、体格检查、实验室测试、影像学异常以及有效靶向药物治疗的证据。本研究根据《赫尔辛基宣言》进行，并经福建中医药大学附属人民医院伦理委员会批准。考虑到研究的回顾性性质，知情同意要求被豁免，所有数据均进行匿名分析。

常规微生物检测

CMTs包括真菌和细菌培养及涂片、结核分枝杆菌（MTB）复合体DNA、GeneXpert MTB/利福平（RIF）检测、酸杆菌涂片、呼吸道病原体PCR分析[如支原体、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）、甲型流感、乙型流感、腺病毒和呼吸道合胞病毒]、甲型和乙型流感抗原、隐球菌抗原（CrAg）、1,3-β-D-葡聚糖（G）和半乳甘露聚糖（GM）抗原、用于耶氏肺孢子菌（PJ）的体液细胞六胺银染色，以及血清病原体IgM和IgG抗体。检测样本包括血液、痰液和BALF。

tNGS panel构建与标本采集

内部tNGS panel设计覆盖363个微生物靶标，包括208种细菌、54种真菌、64种病毒、18种寄生虫以及19种特殊病原体，如立克次体、衣原体、支原体、螺旋体和脲原体。这些微生物包括最常见的呼吸道病原体以及较少见但高毒力的病原体。

从接受支气管镜检查的患者中收集BALF标本（≥5 mL）。标本立即冷藏运送至实验室进行检测。如果标本不能及时送检，则在2°C–8°C下储存最多24小时。所有标本均在独立的第三方检测机构（杭州 Matridx 生物技术有限公司，中国杭州）进行NGS检测和病原体分析。

tNGS检测流程

使用总核酸提取试剂盒（Cat.MD049T；MatriDx Biotech Corp. 杭州，中国）从1.0 mL BALF样本中提取包括DNA和RNA在内的核酸。DNA/RNA提取后，使用病原体靶向多重扩增试剂盒（Cat.MD061X；MatriDx Biotech Corp. 杭州，中国）进行多重PCR，以选择性扩增和富集特定病原体靶序列。使用总DNA/RNA文库制备试剂盒（Cat.MD001T；MatriDx Biotech Corp. 杭州，中国）进行文库制备，包括基因组DNA/RNA的酶切片段化、末端修复、末端腺苷化和接头连接，然后进行纯化。使用KAPA系统通过实时PCR定量文库浓度，并使用Illumina NextSeq 550测序仪（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行测序。每个样本获得总共一百万条读数（最低0.05 M）用于生物信息学分析。所有商业试剂盒在临床应用前均在实验室经过严格的内部验证。测试结果证明了稳定性和可靠性，从而满足验证标准。此外，进行了三次重复性测试，结果表现一致，满足验证要求。

质量控制与生物信息学流程

同时使用阴性和阳性对照来监测和评估潜在污染，以确保每个测序批次的质量。整个实验过程仅涉及单个PCR步骤，并采用片段化文库构建，从而大大降低了后续纯化过程中污染的风险。此外，已开发了几个实验室特定的背景微生物数据库，以追踪试剂和实验环境中的微生物污染，从而有效预防和减轻微生物污染。

生物信息学分析的主要步骤如下：（1）从原始测序读数中排除短（长度<35 bp）、低质量和低复杂度的读数以及接头序列；（2）通过使用Bowtie2（版本2.3.5.1）将其与NCBI中人类特异性数据库（GRCh38.p13）进行比对，消除宿主序列；（3）然后将清洁读数与内部微生物数据库（包括NCBI nt数据库、GenBank和mNGS数据）进行比对，以在物种水平上进行分类。

tNGS报告标准

与先前描述的mNGS检测方法类似，从文库中鉴定出的微生物读数根据严格的报告标准进行报告。关键点包括确保测序数据符合质量控制标准，以及移除未能满足阴性对照标准的标本，以保持真实致病菌与背景环境污染物之间的清晰区分。

除了呈现测序结果外，还在病原体报告中估算了相对丰度。相对丰度的显著增加通常表明样本中微生物物种数量的显著增长。基于此，测试报告通常采用相对丰度≥50%作为常见定植微生物（如呼吸道中的星座链球菌和巨大芬戈尔德菌）的阈值，以指示潜在的致病意义。

tNGS报告中检测到的微生物致病性解释

tNGS报告的结果由三名传染病或微生物检测分析专业且具有生物信息学知识的人员独立解释。确定实际病原体的复合参考标准包括所有实验室测试（包括tNGS）的结果、放射学特征、病理学发现、宿主因素、临床症状、治疗反应和综合临床评估。对于病原体识别中的差异，三位专家组成的小组在全面小组讨论和分析后达成共识。

值得注意的是，在解释tNGS报告时，如果致病意义相当，特定病原体的读数数量越高，表明其作为感染病原体的可能性越大。此外，相对丰度的变化可以作为临床决策的有价值参考，特别是对于定植的厌氧微生物。与先前研究中的标准类似，致病性解释结果分为四类（明确、很可能、可能、不太可能）：（1）明确：tNGS识别的病原体与标本采集后7天内CMTs检测到的结果完全一致，并经病理学检查和/或综合临床评估确认；（2）很可能：基于结合临床发现、影像学结果和实验室测试等的综合评估，tNGS检测到的病原体极有可能是PIs的致病因子；（3）可能：tNGS识别的病原体表现出潜在致病性并与临床特征相符，但存在更合理的替代解释；（4）不太可能：tNGS检测到的病原体具有潜在致病特性，但与综合临床评估结果不一致。明确和很可能的结果被判断为最终诊断的致病因子，而可能和不太可能的结果被判断为最终诊断的非致病因子。

统计分析

使用统计软件（SPSS 19.0；IBM SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）进行数据分析。检查缺失数据发现其完全随机且极少，占所有数据点的<2%。因此，采用列表删除法。计量资料以中位数（四分位距）表示。计数资料以百分比（%）表示，不同检测方法（tNGS、传统培养和CMTs）的诊断性能以灵敏度、特异性、准确性、NPV和阳性预测值表示。使用卡方检验比较诊断效能。在分析之前，验证了卡方检验的假设。由于超过20%的单元格期望计数低于5，因此使用Fisher精确检验代替标准卡方检验。使用受试者工作特征（ROC）曲线分析确定曲线下面积（AUC），用于评估和比较tNGS和CMTs的性能。统计学显著性设定为P < 0.05。

结果

入组患者的特征

2023年12月至2025年1月期间，对127名患者的129份人体标本进行了tNGS检测。最终，110例初步诊断为PIs的患者的110份BALF样本符合纳入标准。入组患者包括93名来自呼吸科的患者，8名来自综合重症监护室，8名来自血液科，1名来自心内科。

110名患者包括80名PIs患者和30名非PIs患者，86名患者（78.2%）有基础疾病，其中50名患有免疫抑制性疾病。中位年龄为59（49, 69）岁，一半患者为女性。

tNGS检测结果

在110份进行tNGS检测的BALF样本中，71份（64.5%）被鉴定为致病病原体。在PIs患者中，接受tNGS前使用抗生素的患者与未使用抗生素的患者之间，病原体检测灵敏度无显著差异[88.4% (61/69) vs. 90.9% (10/11), P > 0.05]。

在71例PIs患者中，tNGS鉴定的病原体结果如图所示。此外，在71例PIs患者（52例）和非PIs患者（19例）中同时检测到119种非致病微生物。最常检测到的病原体是各种病毒（50%，58/116），如人疱疹病毒（75.9%，44/58）和人副流感病毒（13.8%，8/58）。在所有非致病性病毒中，11例（19.0%）在8例（26.7%）非PIs患者中检测到。

不同检测方法对PIs tNGS的比较

tNGS、培养和CMTs对PI诊断的灵敏度存在显著差异（P < 0.001）。在 pairwise 比较分析中，tNGS的灵敏度高于培养（P < 0.001）和CMTs（P = 0.003）；CMTs的灵敏度也高于培养（P < 0.001）。tNGS联合CMTs检测PIs的灵敏度为95.0%（76/80）。tNGS、培养和CMTs对PIs诊断的检测特异性和准确性存在显著差异（分别为P < 0.001和P < 0.001）。进一步分析显示，培养的特异性高于tNGS（P < 0.001）和CMTs（P < 0.001）；然而，tNGS和CMTs之间的特异性无显著差异（P > 0.05）。相反，培养的准确性低于tNGS（P < 0.001）和CMTs（P = 0.022），而CMTs的准确性低于tNGS（P = 0.022）。

tNGS对单一和混合病原体感染的检测灵敏度均高于CMTs（90.2%，46/51 vs. 64.7%，33/51，P = 0.004；84.0%，21/25 vs. 32.0%，8/25，P < 0.001）。与CMTs相比，tNGS在由细菌、非典型病原体和病毒引起的感染中也表现出更优的检测能力（P < 0.05）。然而，真菌的灵敏度在tNGS和CMTs之间无显著差异（P > 0.05），且MTB的灵敏度两种方法均为100%。

tNGS和CMTs诊断PIs的ROC曲线

tNGS和CMTs对PIs的诊断价值通过ROC曲线进行比较，AUC分别为0.627 [95%置信区间（CI），0.752–0.502；P = 0.041]和0.510（95% CI，0.632–0.388；P = 0.867）。

基于tNGS结果的治疗策略调整和临床结局

BALF tNGS检测结果与50名患者（45.5%）临床计划的改变相关。相反，无论tNGS结果如何，28名患者（25.5%）维持了现有的临床管理方案，因为tNGS结果支持当前的诊断和管理。此外，32名患者（29.1%）根据经验判断或CMTs结果接受了调整或未改变的临床方案。

在110名患者中，大多数治愈或好转，仅有9例死亡（8.2%）。在这9名患者中，5名（55.6%）根据tNGS结果调整了抗感染方案。所有5名患者均患有重症肺炎并伴有多种并发症，并接受了升级的抗生素治疗。在5名死亡患者中，4名感染了多重耐药鲍曼不动杆菌，2名在感染初步控制后死于再感染。1名患者感染了多重耐药肺炎克雷伯菌，并在感染控制后因拒绝气管切开导致反复误吸而感染加重死亡。

讨论

在这项单中心研究中，PIs患者的C反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）水平显著高于非PIs患者。在tNGS检测之前，非PIs患者的抗生素使用率低于PIs患者，这与我们之前的发现一致。这一发现可归因于使用CRP和PCT等传统检测标志物初步区分感染与非感染。然而，常规检查的固有局限性使其无法满足临床实践的诊断需求。随着实验室检测技术的快速发展，tNGS作为一种新兴的诊断工具，已获得强大的病原体识别能力，并在临床应用中具有巨大潜力。

本研究证明，使用综合判断标准作为参考，BALF tNGS的病原体检测灵敏度达到88.8%（95% CI，79.2%–94.4%），显著高于培养（22.5% [95% CI，14.2–33.5%]）和CMTs（68.8% [95% CI，58.5–76.6%]）。这些发现与之前的研究一致。如果两种方法结合使用，灵敏度可进一步提高至95.0%。此外，BALF tNGS的灵敏度与之前研究报告的（87.33%）和（89.74%）基本相当，但低于（95.83%）和（97.73%），高于痰液tNGS（80.26%）。不同研究观察到的灵敏度差异可归因于方法学的异质性，包括样本量、标本选择和人群特征的差异。此外，由于病原体DNA在血浆中的存活时间较长，即使经验性抗感染治疗有效，抗生素对mNGS检测结果的影响也相对较小。在本研究中，尽管该队列中86.3%的PIs患者在检测前曾接受过各种抗生素治疗，但tNGS仍表现出高灵敏度，这与之前报告的结果一致。这些发现表明，抗生素使用对tNGS检测的灵敏度没有显著影响。然而，尽管表现出令人满意的灵敏度，但tNGS的特异性仅为36.7%（95% CI，20.5%–56.1%），显著低于培养（96.7% [95% CI，80.9–99.8%]）。在先前的研究中，tNGS对PIs的特异性范围在75.41%至100%之间，大大超过了本研究中观察到的值。造成这种差异的主要原因可能是其他可比研究中非感染相关病例的纳入有限，这可能给结果带来了更大的偏差。值得注意的是，本研究中鉴定出的DNA病毒（特别是各种人疱疹病毒）和PJ主要被临床确认为非致病性，因此无需任何干预。这一发现与之前的报告一致。因此，本研究中观察到的相对较低的特异性也可能归因于在非PIs患者中非致病性DNA/RNA病毒的高检出率（26.7%，8/30）。一个显著的病原体是人疱疹病毒，因为在所有45例阳性结果中，只有一例巨细胞病毒阳性病例被认为具有临床相关性。因此，临床医生在解释检测结果时必须谨慎。特别是，对于疱疹病毒等机会性病原体，它们是常见的潜伏感染，具有再激活倾向，通常仅在免疫抑制患者中具有致病性。医生应全面整合临床数据，避免将检测报告直接等同于诊断结论，从而防止过度诊断和过度治疗。尽管存在这一局限性，tNGS的诊断准确性显著高于培养和CMTs。此外，ROC曲线分析显示，在诊断PIs方面，tNGS比CMTs具有更好的诊断效率。然而，由于其特异性不理想，tNGS的AUC（0.627）相对较低，表明诊断性能一般。未来进一步优化报告标准有望降低假阳性率并提高tNGS的诊断效率。

我们的数据集表明，社区获得性感染构成了PIs的大部分。tNGS对单一病原体、混合感染、细菌、非典型病原体和病毒的检测灵敏度显著高于CMTs，特别是在非典型病原体和RNA病毒的识别方面。传统培养方法对于支原体和衣原体的使用具有挑战性，因为这些微生物的生长要求苛刻，并且血清抗体检测的灵敏度欠佳。对于流感病毒和SARS-CoV-2等RNA病毒，咽拭子核酸或抗原检测是常规且经济高效的一线检测方法。临床医生经常根据具体的临床需求选择合适的实验室检测。这种选择性方法可能导致检测遗漏和病原体识别不完整，特别是在混合感染中。如本研究所示，除混合细菌感染外，最普遍的混合感染类型涉及病毒和细菌的共感染。与CMTs相比，tNGS可以同时检测多种病原体，包括DNA和RNA微生物，在一次检测中全面覆盖常见的临床病原体。tNGS在病毒感染的早期诊断中表现出显著优势，包括高准确性、快速检测、有效区分各种病毒类型以及识别混合感染的能力。这可以促进快速识别目标病原体，并实现精确的靶向抗感染治疗。

值得注意的是，tNGS在真菌检测方面未能表现出任何显著优势。进一步分析表明，在真菌感染的诊断中，CMTs主要依赖于血清或BALF中真菌抗原的检测，特别是通过G、GM和CrAg测试。然而，由于G试验阳性结果不能直接识别特定的真菌种类，其在指导抗真菌药物选择方面的效用有限。tNGS在隐球菌检测方面也没有显示出明显优势。例如，在两例肺隐球菌病中，血清CrAg检测均显示阳性结果，而只有一例tNGS结果阳性，且有一例假阳性结果。因此，对于疑似隐球菌感染的患者，推荐将CrAg检测作为主要诊断工具。如果CrAg结果为阴性，如先前mNGS研究中所观察到的，将其与tNGS结合可能会提高灵敏度。此外，tNGS和CMTs对MTB检测的灵敏度相当，这与我们之前关于mNGS的发现相反。这种差异可归因于我们实验室最近引入了MTB DNA检测和GeneXpert MTB/RIF耐药性检测 assay，这大大增强了结核病的诊断能力。由于本回顾性研究中包含的肺结核病例数量有限（6.4%，7/110），关于tNGS在检测MTB方面应用的数据可能不具有完全代表性。此外，我们实验室目前仅配备进行GeneXpert MTB/RIF耐药性检测 assay，无法满足评估对其他抗结核药物耐药性的临床需求。由于尚未建立进行基于生长的表型药物敏感性测试（pDST）的必要条件，并且缺乏pDST作为参考标准，未对通过tNGS获得的病原体耐药性检测数据进行分析。因此，本研究中获得的有限数据不足以提供有力证据支持使用tNGS作为检测MTB的主要方法。尽管如此，小样本量显示tNGS检测MTB的阳性率很高（100%），不劣于CMTs。因此，tNGS可以作为传统MTB检测的补充诊断工具。此外，普通实验室在识别非结核分枝杆菌（NTM）方面存在局限性。例如，对于抗酸染色阳性的标本，这些实验室无法区分MTB和NTM或确定NTM亚型，而这对于制定适当的用药计划至关重要。相比之下，tNGS在解决这一问题方面表现出强大的能力。

由于tNGS显著提高了病原体检测的灵敏度和诊断效率，与传统培养方法（13 vs. 48小时）和CMTs相比，它为临床策略的制定提供了关键指导。在本研究中，tNGS结果被用于调整45.5%（50/110）患者的临床治疗计划。调整主要涉及在识别致病病原体后启动靶向抗感染治疗（16.4%，18/110）和升级抗生素方案（19.1%，21/110）。先前的一项研究表明，接受mNGS检测的患者抗生素升级率低于接受CMTs检测的患者（19.0% vs. 26.8%），表明mNGS检测与抗生素升级可能性降低相关。本研究中抗生素升级率相对较低，这可能归因于tNGS对临床决策的积极影响。经验性抗微生物治疗已在临床实践中广泛采用。然而，如果没有后续实验室测试结果的强有力的支持，病情的可变性和复杂性可能导致在诊断和治疗过程中频繁更换治疗药物和不适当的抗生素使用升级。基于tNGS的优势，当经验性抗菌治疗已经涵盖tNGS检测到的病原体时，主治医师更可能根据临床情况决定不升级抗生素方案。因此，尽管本研究中25.5%的患者在tNGS后未调整抗感染方案，但这并不意味着tNGS未对这些患者提供治疗指导。相反，tNGS提供的及时、全面的微生物结果使临床团队能够更快速、更精确地确定最终治疗方案，最大限度地减少不必要的调整和抗生素使用升级。一个典型的例子是衣原体感染，这是一种在常规实验室中不易检测到的病原体。在本研究中，经tNGS确认感染鹦鹉热衣原体的6名患者中，有5名在tNGS检测前已得到准确的经验性治疗。然而，在两例中，尽管使用莫西沙星和左氧氟沙星经验性治疗后症状有所改善，但双肺病变并未明显吸收。基于tNGS结果，维持了原始治疗计划，患者最终治愈，避免了不必要的抗生素升级。值得注意的是，另外三例出现持续发热。基于tNGS结果，所有三名患者均通过在使用先前给予的喹诺酮药物（左氧氟沙星或莫西沙星）基础上补充多西环素成功治疗。结果，患者体温恢复正常。尽管这三例因使用了联合治疗而被归类为涉及抗生素升级，但这种方法避免了对更高级别抗生素（如酶抑制剂组合或碳青霉烯类）的需求，从而防止了治疗方向的潜在偏差。此外，本研究中仅有一例涉及抗生素治疗降级（不包括8名确认无感染因此停用抗菌药物的患者），这是一个非常低的频率。这一发现与之前报告的mNGS研究结果一致，可能主要归因于结果解释方面的挑战，例如在mNGS中遇到的那些。尽管tNGS在筛选目标病原体时可以检测到多种机会性致病菌和正常呼吸道定植菌，但它目前与mNGS共享一个局限性：无法有效区分致病微生物和定植微生物。这一挑战严重干扰了关于抗生素治疗降级的决策过程。tNGS和CMTs结果之间也存在不一致之处。在本研究中，大约30%的治疗方案是根据CMTs确定的。具体来说，临床医生倾向于采用由CMTs结果指导的相对保守的抗生素方案，而不是仅仅依靠tNGS结果来降低治疗级别。这进一步表明，tNGS可以作为CMTs的有价值补充，而不是完全取代常规实验室技术。

9名患者死亡，其余患者病情稳定、好转或完全康复。5名患者根据tNGS检测结果接受了升级的抗生素治疗。在这些患者中，有3名最初感染得到控制且临床状况有所改善；然而，他们的感染随后复发并恶化，最终导致治疗失败。对根本原因的分析表明，所有5名患者均病情危重，患有多重合并症，并且感染了多重耐药菌。这些因素共同导致有效治疗选择有限，并大大增加了治疗复杂性。尽管存在这些局限性，tNGS的快速检测和高灵敏度允许在早期阶段识别病原体，并显示出其在指导重症肺炎抗感染治疗方面的巨大潜力。

然而，本研究存在某些局限性，值得承认。首先，这是一项单中心、回顾性研究，样本量相对较小。这可能导致数据偏差。然而，本研究的样本量显著大于类似研究[n = 8；n = 50；和n = 61]或与其他相对较大的研究[n = 130]和[n = 150]相当。值得注意的是，一些发现与先前的研究不一致，特别是在特异性方面，相对较低。因此，需要通过更大样本量或多中心合作的研究进行额外验证。其次，由于我院不是专科结核病医院，缺乏进行MTB和NTM培养的能力。这一局限性导致传统培养方法的阳性检测灵敏度较低。第三，鉴于一些患者在通过tNGS快速识别目标病原体后立即开始靶向抗感染治疗，某些常规检测程序，如BALF中流感病毒、SARS-CoV-2和支原体的核酸检测，不再进行。这可能降低了CMTs的实际检测灵敏度。第四，tNGS经常识别出大量非致病微生物。该技术缺乏区分定植菌和