基于16S rRNA测序技术解析复发性流产患者子宫内膜液微生物组特征及其临床意义

本研究利用16S rRNA基因测序技术，系统分析了复发性流产（RPL）患者子宫内膜液微生物组的组成特征，发现其β多样性显著区别于健康对照组，并鉴定出弧菌属（Vibrio）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）与RPL显著正相关，为理解微生物失衡在生殖健康中的作用提供了新视角。

　　

引言

复发性流产（Recurrent Pregnancy Loss, RPL）是生殖医学领域的一大挑战，其病因复杂且治疗手段有限。根据欧洲人类生殖与胚胎学会的定义，RPL指连续发生两次或以上的自然流产，影响约1-3%的育龄夫妇。子宫内膜作为母体与胚胎之间的关键界面，其动态变化对胚胎发育至关重要。近年来的研究表明，生殖道微生物群在妇科感染性疾病、肿瘤及内分泌失调的发病机制中扮演重要角色。尽管子宫内膜曾长期被认为是无菌环境，但随着测序技术的进步，子宫内膜微生物群的存在及其与RPL的潜在关联逐渐受到关注。本研究旨在通过16S rRNA基因测序技术，比较RPL患者与健康对照组子宫内膜液样本的微生物组成，揭示微生物失衡与生殖失败之间的关联。

材料与方法

本研究为病例对照设计，于2023年3月至9月在兰州大学第二医院招募了114名参与者，包括68名RPL患者和46名健康对照。所有参与者均为自然受孕，且排除了解剖异常、染色体异常、血栓形成倾向、抗磷脂综合征、内分泌疾病及其他重大器质性疾病。子宫内膜液样本在月经周期第2-7天采集，严格遵循无菌操作流程。样本通过宫腔灌注生理盐水并立即吸取获得，储存于-80°C直至分析。

微生物基因组DNA采用CTAB法提取，针对16S rRNA基因的V4区（引物515F-806R）进行PCR扩增。扩增产物经纯化、建库后，在Illumina平台上进行测序。原始数据经过质量过滤、去嵌合体等预处理后，使用QIIME2进行ASV（Amplicon Sequence Variant）聚类和物种注释。α多样性通过Chao1、Observed features、Simpson和Shannon指数评估，β多样性基于加权UniFrac距离进行主坐标分析（PCoA）。为控制年龄、BMI、教育水平、种族、空腹血糖（FBG）及血脂指标等混杂因素的影响，采用半偏相关分析探索微生物类群与RPL的关联，并使用LEfSe（LDA>4，P<0.05）鉴定组间差异显著的微生物类群。

结果

患者基线特征显示，两组在年龄、身高、体重及教育水平上存在显著差异，对照组年龄较大且教育水平较低。低密度脂蛋白（LDL）水平在对照组中显著较高，其他生化指标无显著差异。

在门水平上，两组微生物组成均以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主，但RPL组中蓝藻门（Cyanobacteria）的相对丰度显著低于对照组（p=0.015）。然而，经混杂因素调整后，蓝藻门的差异不再显著。

属水平分析揭示，对照组中以乳酸杆菌属（Lactobacillus）为绝对优势菌，其次为加德纳菌属（Gardnerella）、假单胞菌属（Pseudomonas）等。RPL组中，弧菌属（Vibrio）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）的相对丰度显著升高（p<0.05）。半偏相关分析进一步确认，这两个属与RPL呈正相关（p<0.05），提示它们可能在RPL的发病机制中发挥作用。

多样性分析表明，两组间α多样性无显著差异（p>0.05），但β多样性分析（PCoA）显示微生物群落结构存在显著分离（R2=0.022，p=0.015），表明RPL患者子宫内膜微生物组成与健康对照组截然不同。

LEfSe分析鉴定出假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、假交替单胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）和肠杆菌目（Enterobacterales）在RPL组中显著富集，与半偏相关分析结果一致。

讨论

正常的子宫内膜微生物群通过维持抗菌屏障、调节免疫细胞平衡及控制炎症因子释放，为胚胎植入提供有利环境。本研究发现RPL患者虽在微生物丰富度和均匀度（α多样性）上与对照组无差异，但其群落结构（β多样性）发生显著改变，且特定病原相关菌属如弧菌属和假交替单胞菌属显著富集。

弧菌属常见于水生环境，部分种类可引发胃肠道疾病，其促炎特性可能破坏子宫内膜免疫平衡，干扰胚胎植入。假交替单胞菌属以其产生的生物活性化合物著称，这些化合物可能抑制有益菌（如乳酸杆菌）生长，导致菌群失调和局部炎症反应，进而影响妊娠维持。LEfSe分析进一步验证了假交替单胞菌属在RPL组中的富集，强调了其在微生物失衡中的潜在作用。

本研究也存在一定局限性：样本量较小且为单中心设计，结论外推需谨慎；横断面研究无法确立因果关系；16S rRNA测序在低生物量样本中易受污染干扰。未来需扩大样本量、开展纵向研究，并结合宏基因组学与转录组学深入探索相关微生物的功能机制。

结论

本研究揭示了RPL患者子宫内膜微生物群落结构的特异性改变，特别是弧菌属和假交替单胞菌属的显著富集，表明微生物失衡可能参与RPL的发病过程。这些发现为开发针对微生物组的干预策略（如益生菌调节或抗生素靶向治疗）提供了理论依据，有望改善RPL患者的妊娠结局。